Ensayo basado en luciferasa para evaluar compuestos antivirales en células de riñón embrionario humano

Resumen

Fuente: Lucas-Hourani, M. et.al., Búsqueda de alto rendimiento de inhibidores químicos de amplio espectro contra virus de ARN. J. Vis. Exp. (2014)

Este video muestra un ensayo antiviral basado en luciferasa en células de riñón embrionario humano infectadas con virus del sarampión recombinante. Se observa que los compuestos de prueba diluidos en serie inhiben la replicación viral, lo que provoca una menor luminiscencia de manera dependiente de la dosis, al tiempo que se mantiene la viabilidad de las células huésped.

Protocolo

1. Preparación de cultivos celulares infectados con el virus del sarampión (MV) que expresa luciferasa de luciérnaga (rMV2/Luc)

1. Cultive células HEK-293T a 37 °C y 5% CO₂ en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con L-glutamina estabilizada y suplementado con 10% de suero de feto bovino (FCS), estreptomicina (100 μg/ml) y penicilina (100 UI/ml). Las células se pasan mediante tripsinización cada 4-5 días y se diluyen 1:10 en un matraz nuevo. Las células deben estar en fase logarítmica para los experimentos.
2. El día del experimento, recupere las células mediante tripsinización y realice un recuento celular. Peline las células por centrifugación y resuspenda a 3 x 10⁵ células/ml en medio de cultivo. Tenga en cuenta que se requieren 12,5 ml de suspensión celular por cada placa de tamizaje.
3. Nuevamente, resuspenda las células a 3 x 10⁵ células/ml en medio de cultivo. Tenga en cuenta que se requieren 12,5 ml de suspensión celular por cada placa de tamizaje.
4. Opcional: suplemente el medio de cultivo con uridina a 20 μg/ml.
   NOTA: Al tamizar bibliotecas químicas en busca de inhibidores de la replicación viral, parece que con frecuencia se aíslan compuestos que actúan sobre las etapas iniciales de la vía de biosíntesis de pirimidinas. La adición de uridina al medio de cultivo se utiliza para filtrar tales moléculas antivirales. De hecho, esto restaura eficazmente la replicación viral cuando las enzimas upstream de la vía de biosíntesis de pirimidinas están bloqueadas.
5. Guarde 1:10 de la suspensión celular para pozos de control con células no infectadas y proceda a la infección con el volumen restante.
6. Descongele el volumen adecuado de la solución stock de rMV2/Luc. Las soluciones stock de MV suelen contener entre 10⁶-10⁸ partículas infecciosas por ml. El cultivo debe infectarse con 0,1 partículas infecciosas de rMV2/Luc por célula diana, lo que corresponde a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1. 
   NOTA: rMV2/Luc se deriva de la vacuna contra el sarampión (cepa Schwarz) y se manipula en un entorno BSL2.
7. Añada el virus a la suspensión celular y mezcle suavemente. Transfiera las células infectadas a un depósito y distribuya 100 μl de suspensión celular infectada en las columnas 2 a 11 de placas D2 que contienen compuestos químicos añadidos. La suspensión celular dentro del depósito se mezcla suavemente de forma regular.
8. En las columnas 1 y 12, distribuya 100 μl de células no infectadas en cada pozo. Las células infectadas se distribuyen en los demás pozos.
9. Incube las células durante 24 h a 37 °C y 5% CO₂.

2. Cribado secundario para toxicidad y actividad antiviral de amplio espectro

1. Realice diluciones seriadas 1:2 para cada compuesto activo en dimetilsulfóxido (DMSO), comenzando desde 500 µM hasta 4 µM (8 diluciones). Llene placas de cultivo celular blancas con código de barras con 50 µl de medio de cultivo. Añada 1 µl de cada dilución del compuesto a los pocillos de cultivo. Repita dos veces para obtener 3 placas de cultivo con diluciones seriadas duplicadas para cada compuesto activo.
2. Prepare 37,5 ml de una suspensión celular de HEK-293T a 6 x 10⁵ células/ml en medio de cultivo como se describió anteriormente (en 1.1 y 1.2). Distribuya 2x 12,5 ml en tubos Falcon e infecte las células con rMV2/Luc a una MOI = 0,1 o con virus recombinante del chikunguña (CHIKV) que expresa luciferasa Renilla (CHIKV/Ren) a una MOI = 0,2. Mezcle invirtiendo los tubos.
   NOTA: CHIKV/Ren se deriva de una cepa silvestre de CHIKV y, por lo tanto, debe manipularse en un entorno BSL3. Las placas pueden trasladarse de BSL3 a BSL1 una vez que se haya añadido el sustrato de Renilla a los pocillos de cultivo (véase más abajo).
3. Distribuya 50 µl de células no infectadas, infectadas con rMV2/Luc o infectadas con CHIKV/Ren en placas de cultivo que contengan diluciones seriadas de los compuestos activos. Incube durante 24 horas a 37 °C.
4. Añada 50 µl de sustrato de luciferasa de luciérnaga para determinar la actividad de luciferasa de luciérnaga en los pocillos infectados con rMV2/Luc. Añada 50 µl de sustrato de luciferasa Renilla para determinar la actividad de luciferasa Renilla en los pocillos infectados con CHIKV/Ren. Finalmente, añada 50 µl de reactivo de ensayo de viabilidad basado en luciferasa a las células no infectadas para determinar la viabilidad celular.
5. Represente gráficamente los datos (Figura 1) y determine las concentraciones de los compuestos activos que inhiben la replicación de MV y CHIKV en un 50 %. Descarte los compuestos que muestren alguna toxicidad en este ensayo.

Resultados

Figura 1. Actividad antiviral y toxicidad dependientes de la dosis de los compuestos C864, C648 y C062. (A) Las células HEK-293T fueron infectadas con la cepa rMV2/Luc del virus del sarampión (MV) que expresa luciferasa (MOI=0,1) e incubadas con dosis crecientes de C864, C648, C062 o solo DMSO. Tras 24 horas, se determinó la expresión de luciferasa. * indica que las inhibiciones observadas de luciferasa fueron estadísticamente significativas con los tres compuestos (valores de p < 0,05). (B) Las células HEK-293T fueron infectadas con la cepa CHIKV/Ren del virus del chikunguña (CHIKV) que expresa luciferasa Renilla (MOI=0,2) e incubadas con dosis crecientes de C864, C648, C062 o solo DMSO. Tras 24 horas, se determinó la expresión de luciferasa Renilla. * indica inhibiciones estadísticamente significativas con los tres compuestos (valores de p < 0,05). (C) Las células HEK-293T fueron incubadas con dosis crecientes de C864, C648, C062 o solo DMSO. Como control de toxicidad, los cultivos celulares se suplementaron con 2,5 μl de una solución al 0,5 % de IGEPAL. Tras 24 horas, se determinó el número de células vivas mediante el ensayo de viabilidad basado en luciferasa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plataforma Freedom EVO	TECAN		Plataforma robótica
Microplacas de cultivo celular de poliestireno de 96 pocillos, blancas	Greiner Bio One	655083
Ensayo luminiscente de viabilidad celular CellTiter-Glo	Promega	G7570	Ensayo de viabilidad basado en luciferasa
Sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo	Promega	E2610	Reactivo que contiene sustrato de luciferasa de luciérnaga
Sistema de ensayo de luciferasa Renilla-Glo	Promega	E2710	Reactivo que contiene sustrato de luciferasa Renilla
Sistema de ensayo de gen reportero Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	Reactivo que contiene sustrato de luciferasa de luciérnaga. Puede utilizarse como alternativa al reactivo Bright-Glo para determinar la actividad de la luciferasa.