Aislamiento de un único virus gigante a partir de una población viral mixta utilizando amebas

Resumen

Fuente: Sahmi-Bounsiar, D. et al. La microaspiración de una sola célula como una estrategia alternativa a la clasificación de células por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la microaspiración de una sola célula para aislar y amplificar una población individual de virus gigantes a partir de una población viral mixta, utilizando amebas como células huésped.

Protocolo

1. Cultivo de amebas

1. Utilice Vermamoeba vermiformis (cepa CDC19) como soporte celular.
2. Añada 30 mL de medio de proteasa-peptona-extracto de levadura-glucosa (PYG) (Tabla 1) y 3 mL de amebas a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL en un frasco de cultivo celular de 75 cm².
3. Mantenga el cultivo a 28 °C.
4. Después de 48 h, cuantifique las amebas utilizando láminas de recuento.
5. Para lavar, recoja las células a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL y forme un sedimento de amebas mediante centrifugación a 720 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en el volumen adecuado de medio de inanición para obtener 1 x 10⁶ células/mL (Tabla 1).

2. Dilución en punto final

1. Realice una dilución seriada (10^-1 a 10^-11) de la muestra viral en medio de ayuno (Tabla 1).
2. Inocule 2 mL de 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis en cada placa de Petri con 100 µL del inóculo de la mezcla.
3. Coloque las placas de Petri en una bolsa de plástico sellable a 30 °C.
4. Comience a observar las placas de Petri mediante microscopía óptica invertida a las 6 h posteriores a la infección y revise la morfología celular cada 4 a 8 h.
5. Al aparecer el efecto citopático caracterizado por el redondeo celular, inicie el proceso de microaspiración de célula individual.

3. Microaspiración de célula individual

1. Preparar el hospedador
   NOTA: Esta preparación se realiza para liberar células individuales infectadas a un soporte celular fresco.
   1. Tratar las amebas en cultivo con un agente antimicrobiano que contenga 10 µg/mL de vancomicina, 10 µg/mL de imipenem, 20 µg/mL de ciprofloxacina, 20 µg/mL de doxiciclina y 20 µg/mL de voriconazol. Esta mezcla se utiliza para evitar la contaminación bacteriana y fúngica.
      NOTA: El procedimiento se lleva a cabo en una mesa fuera de la cabina de seguridad microbiológica. Añadir 2 mL de amebas concentradas a 1 x 10⁶ células/mL en cada una de 15 placas de Petri. Para la adherencia de las amebas, incubar el cultivo a 30 °C durante 30 min.
2. Seleccionar la placa de Petri utilizada para la microaspiración a partir de la dilución límite según los siguientes criterios: 1) ausencia de cualquier contaminación visible por agentes fúngicos y bacterianos, 2) evidencia de efecto citopático en las amebas debido a los virus, y 3) fase de prelisis y redondeo de las amebas (para evitar la aspiración de partículas virales).
3. Preparar un puesto de trabajo con los siguientes materiales (Figura 1A,B): Micromanipulador, que permite la posición de la microcapilar; Dispositivo manual de control de presión, utilizado para aspirar y liberar las células dentro de la microcapilar; Microscopio invertido; Módulos motores plug and play; Cámara; Módulo informático para visualizar la manipulación y tomar imágenes.
4. Elegir una microcapilar (Figura 1C).
   NOTA: El tamaño de las células, la deformación y la adhesión de sus membranas a las superficies, así como la motilidad celular, pueden afectar el progreso adecuado de la microaspiración. El diámetro de la microcapilar puede seleccionarse y adaptarse con precisión a tipos celulares específicos según su tamaño y los métodos de aspiración. Se utilizó una microcapilar de 20 µm de diámetro interno para aspirar una ameba redondeada (diámetro ~10 µm). Esto permite mantener una posición interna estable y una liberación fácil de la célula.
5. Montar el sistema.
   1. Fijar el ángulo de operación del sistema de sujeción en el módulo motorizado a 45°.
   2. Realizar una instalación doble, primero en el sistema de sujeción y luego en la microcapilar.
   3. Enfocar las células después de hacer pasar unas gotas de aceite a través de la microcapilar.
      NOTA: El aceite mineral con compatibilidad biológica es suministrado por el dispositivo.
   4. Completar el montaje siguiendo las recomendaciones del fabricante.
6. Clonar células (Figura 2A,B)
   1. Colocar la placa de Petri que contiene 2 mL de amebas infectadas bajo el microscopio.
   2. Enfocar primero las células y luego la microcapilar sumergida en el cultivo.
   3. Seleccionar una célula individual redondeada y acercar la microcapilar al micromanipulador.
   4. Ejercer una aspiración suave mediante el control manual de presión sobre la célula, introduciéndola dentro de la microcapilar. Retirar la célula individual de la primera muestra y liberarla en el soporte celular, luego incubarla a 30 °C.
   5. Realizar observaciones diarias con un microscopio óptico invertido para observar la morfología celular y monitorear la aparición del efecto citopático.

Tabla 1: Composición de los medios de cultivo

Resultados

Figura 1: Materiales para la micromanipulación. (A) Configuración real del puesto de trabajo. (B) Ilustración esquemática de los componentes del puesto de trabajo. (C) Ilustración esquemática de la microcapilar.

Figura 2: Pasos de la microaspiración. (A) Procedimiento de aislamiento de células individuales (aumento x40). (B) Ilustración esquemática de los diferentes pasos de la aspiración de células individuales: 1) Localización de la célula. 2) Aspiración de la célula. 3) Paso de liberación. Las flechas negras indican la microcapilar y las blancas indican la célula individual.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraces para cultivo celular Corning de 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Cultivo
Matraces para cultivo celular Corning de 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Cultivo
Matraces para cultivo celular Corning de 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Cultivo
Cámara DFC 425C	LEICA	Unkown	Observación/monitoreo
Microscopio invertido Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Observación/monitoreo
Microcapilar de 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiración y liberación de células
Micromanipulador InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Posicionamiento del microcapilar
Placa de Petri de 35 mm	Ibidi	81158	Cultivo/observación