Clasificación basada en fluorescencia de partículas virales individuales para análisis genómico

Resumen

Fuente: Zeigler Allen, L., et al. Aislamiento y análisis genómico de viriones individuales mediante 'genómica de un solo virus'. J. Vis. Exp. (2013).

Este video demuestra cómo la citometría de flujo permite el aislamiento de virus individuales que contienen genoma a partir de poblaciones mixtas mediante detección basada en fluorescencia y clasificación precisa de partículas, seguida de inclusión en agarosa para la posterior caracterización genómica.

Protocolo

1. Preparación de Suspensiones Virales

Antes del aislamiento de viriones individuales mediante citometría de flujo, prepare suspensiones virales sin fijar.

1. Aísle partículas virales utilizando protocolos previamente establecidos, asegurándose de que la suspensión viral final esté contenida en TE (Tris-EDTA, pH 8) filtrado a 0,1 μm. Recomendamos usar enfoques de filtración tangencial de flujo (TFF), aunque se han desarrollado otros métodos que utilizan floculación química.
2. Enumere partículas virales utilizando protocolos establecidos, por ejemplo, mediante epifluorescencia 8-10 o citometría de flujo.
3. Aliquote la suspensión viral en dos tubos Eppendorf (se recomienda un volumen final de 1.000 μl).

2. Citometría de flujo

1. Para clasificar virus mediante el citómetro de flujo BD FACSAria II equipado con un PMT personalizado de dispersión hacia adelante (FSC PMT), diluya las partículas virales en 0.1 μm-filtrado TE, pH 8,0 hasta una titulación adecuada para una tasa de eventos de 200 eventos por segundo^-1.
2. Establezca umbrales para maximizar las relaciones señal-ruido; por ejemplo, para un conjunto mixto que contenga partículas de fagos T4 y lambda, se recomiendan los siguientes valores: FSC PMT en 1.000 y SSC en 200.
3. Ejecutar 100 μl de "en blanco" muestras que contienen únicamente 1) 0.1 μm-TE filtrado de 0,1 μm y 2) 0.1 μmTE filtrado de 0,1 μm y SybrGreen1 a una dilución de 1e-4 del stock (10.000X).
4. Analice una pequeña alícuota (100 μl se recomienda) de suspensión viral no teñida para evaluar el fondo, seguido de la suspensión viral teñida (SybrGreen1 a una dilución de 1e-4 del stock), hasta alcanzar un total de 5.000 eventos para cada tipo de partículas virales. Esto permite verificar la concentración y ajustar las compuertas de clasificación, si es necesario, antes de la clasificación. Se recomienda una compuerta estrecha en el centro de las partículas virales. Además, para generar las compuertas utilizamos la gráfica de SYBR Green y FSC PMT.
5. Añadir 5 μl de agarosa al 1 % de punto de fusión baja (LMP) (en tampón TBE) enfriada a 37 °C a cada pocillo de una placa microscópica de politetrafluoroetileno (PTFE) (Electron Microscopy Sciences).
6. Cargue la portaobjetos microscópica de politetrafluoroetileno (PTFE) en el citómetro de flujo para capturar las partículas virales ordenadas.
7. Iniciar la clasificación de partículas virales teñidas con SYBR green directamente sobre la placa de PTFE con agarosa de punto de fusión baja (LMP). Se recomienda clasificar 10 o más eventos (partículas virales) en algunos pozos para facilitar la detección de la profundidad de los virus durante la microscopía de barrido láser confocal (CSLM).
8. Cuando finalice la clasificación, retire la placa del citómetro de flujo y agregue 5 μl más agarosa de punto de fusión baja enfriada a 37 °C a cada pocillo, encapsulando así la(s) partícula(s) viral(es).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Buffer TE 1X	Invitrogen	12090-015
Fenol saturado con buffer	Invitrogen	15513-039
Agarosa de punto de fusión baja (LMP)	Invitrogen	16520100
Portaobjetos microscópico de politetrafluoroetileno (PTFE)	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 pocillos, 4 mm de diámetro
β-agarasa	New England Biolabs	M0392S