Enriquecimiento de virus gigantes a partir de una muestra de agua ambiental mediante el uso de amebas

Resumen

Fuente: Bou Khalil, J. Y.,et al. Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustovirus a partir de muestras ambientales utilizando Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el enriquecimiento de virus gigantes a partir de una muestra de agua ambiental utilizando un co-cultivo basado en amebas para permitir la detección y el análisis posteriores.

Protocolo

1. Recolección de muestras

1. Recolecte 70 muestras de diferentes ambientes y regiones. En este caso, utilice las siguientes: 5 muestras de agua contaminada del pueblo de Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 muestras del lago en el Parc Borély en Marsella (Francia); 15 muestras de agua de mar con sedimento de las ensenadas rocosas en Samena en Marsella (Francia), 25 muestras de agua de río de los Alpes (Francia) y, finalmente, 10 muestras de aguas residuales de La Ciotat (Francia).
2. Vortexee las muestras durante un minuto a temperatura ambiente sin ningún tratamiento para homogeneizarlas antes de la inoculación.

2. Procedimiento de aislamiento

1. Preparación del hospedador para procedimientos de cultivo ciego e inoculación de muestras
   1. Utilice Vermamoeba vermiformis (cepa CDC19) como soporte celular para el co-cultivo.
   2. Mantenga las amebas a 28 °C, en un matraz de cultivo celular de 75 cm² con 30 ml de medio de proteasa-peptona-extracto de levadura-glucosa (PYG). Consulte la composición del PYG en la Tabla 1.
      NOTA: Después de 48 h, se cuantifican las amebas mediante un recuento normal utilizando láminas contadoras (por ejemplo, Kovaslides).
   3. Recoge las células a una concentración de 5 x 10⁵ a 10⁶ células/ml, y forme el sedimento de amebas mediante centrifugación a 720 x g durante 10 min.
   4. Elimine el sobrenadante por aspiración, y resuspenda el sedimento de amebas en 30 ml de solución salina amebiana estéril de Page (PAS) Tabla 1. Repita este procedimiento de lavado.
   5. Resuspenda las amebas en 30 ml de medio de inanición con una mezcla de antibióticos y antifúngicos a una concentración de aproximadamente 10⁶ amebas/ml. El medio de inanición es un medio de supervivencia para la ameba, que le permite mantenerse viva sin encistar ni multiplicarse. Consulte la composición en la Tabla 1.
      NOTA: La mezcla de agentes antimicrobianos contenía 10 µg/ml de vancomicina, 10 µg/ml de imipenem, 20 µg/ml de ciprofloxacino, 20 µg/ml de doxiciclina y 20 µg/ml de voriconazol. Esta mezcla sirvió para reducir la contaminación bacteriana y fúngica que podría disminuir o alterar la multiplicación viral.
   6. Inocule directamente 25 µl de cada muestra sobre la monocapa de 200 µl de amebas en una placa de 96 pocillos con fondo plano que favorezca la adherencia de las amebas e incube a 30 °C en un ambiente húmedo (un ambiente húmedo consiste en colocar una compresa húmeda dentro de la bolsa que contiene la placa para evitar la evaporación). Este es el cultivo primario. Deje dos pocillos con amebas sin inoculación de muestra; esto actúa como control negativo. Incube este cultivo primario durante tres días.
   7. Tres días después de la primera inoculación, subcultive la placa del cultivo primario en amebas frescas según se describió anteriormente, sin realizar ninguna observación microscópica. Incube la nueva placa durante tres días en las mismas condiciones que el cultivo primario.
   8. Realice el cultivo final después de estos tres días de incubación, de la misma manera que para los cultivos primario y subcultivo. Incube el cultivo final durante dos días. A continuación, proceda a la detección.

Tabla 1. Recetas de soluciones

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de proteasa-peptona-extracto de levadura-glucosa (PYG), solución salina amebiana de Page (PAS), medio de inanición	Producción casera del laboratorio	Marseille URMITE	x
Cepa de ameba CDC-19	ATCC	Francia	50237
Placas	Cellstar	Francia	655180
Matraces	SARSTEDT	Alemania	833911
Ultracentrífuga Sorval WX 80	Thermo scientific	Francia	9102448