Este video demuestra el ensayo de focos de fluorescencia utilizado para cuantificar el virus de la hepatitis C infeccioso en cultivo celular. Se muestra la dilución seriada del sobrenadante viral, la infección de células de hepatoma y la detección de sitios de replicación viral mediante microscopía de fluorescencia basada en anticuerpos.
Artículo de método
Cuantificación del virus de la hepatitis C infeccioso mediante microscopía de fluorescencia
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30 de septiembre de 2026
En este artículo
Resumen
Protocolo
1. Medición del título viral
- Siembre células Huh-7.5.1 vírgenes a aproximadamente 3 x 103 células/pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realice diluciones seriadas de 10 veces del sobrenadante de cultivo libre de células obtenido de células transfectadas con ARN del virus de la hepatitis C (VHC) utilizando medio de crecimiento e inocule por triplicado sobre células Huh-7.5.1.
- Fije las células a las 72 horas postinfección usando metanol (durante 30 minutos a -20 ºC) e inmunotincione para la proteína NS5A del VHC.
- Lave las células con PBS tres veces y bloquee con tampón bloqueante para IFA.
- Utilice anticuerpo primario policlonal de conejo anti-NS5A o anticuerpo monoclonal de ratón anti-ARNds J2 a una dilución de 1:200 (1 μg/ml) e incube de 5 horas a toda la noche a 4 ºC.
- Lave las células con PBS tres veces después del anticuerpo primario.
- Añada anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-IgG de conejo-488 o anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-IgG de ratón-594 a una dilución de 1:1.000 (1 μg/ml) e incube durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lave las células con PBS tres veces y observe mediante microscopía de fluorescencia.
- Utilice la dilución más alta para contar los focos positivos para NS5A y calcule el número promedio de unidades formadoras de focos (FFU) por mililitro. Vea Figura 1 para la titulación del VHC.
Resultados
Figura 1. Evaluación de la infectividad del VHC de tipo salvaje y medición del título viral. A) Se utilizaron células Huh-7.5.1 naïve para los estudios de infección. El sobrenadante libre de células recolectado a las 48 y 96 horas post-transfección (hpt) del ARN del VHC se sometió a diluciones seriadas de 10 veces y se añadió a las células en una placa de 96 pozos por triplicado. A las 72 horas post-infección, las células se fijaron e inmunotincharon para la proteína NS5A del VHC. Las células con tinción positiva para NS5A (rojo) están infectadas con el virus. Para evaluar la Unidad Formadora de Focos (FFU), se contaron los focos positivos en la dilución más alta. Se muestran paneles representativos de imágenes (Barra de escala: 100 μm). B) En la gráfica se muestran los valores medios y las desviaciones estándar del título viral en unidades formadoras de foco (FFU) por mililitro. El mutante nulo de la polimerasa no produjo partículas infecciosas. WT: tipo salvaje; Pol-: nulo de polimerasa.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | La línea celular fue amablemente proporcionada por el Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami bajo un acuerdo MTA firmado entre The Scripps Research Institute y Cedars-Sinai Medical Center | |
| Anticuerpo monoclonal de ratón anti-RNA bicatenario J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 |
