Este video demuestra el uso de la química click y la microscopía de fluorescencia para visualizar la transcripción de ARN recién sintetizado en células de mamífero. Destaca cómo la infección viral suprime la transcripción del huésped mediante la comparación de las señales fluorescentes entre células infectadas y células de control.
Artículo de método
Visualización de la supresión transcripcional en células infectadas por virus
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30 de septiembre de 2026
En este artículo
Resumen
Protocolo
Infecte células con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12 y marque el ARN recién sintetizado con 5-etiniluridina (EU)
- Siembre células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) en una placa de cultivo celular de 6 pocillos con medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco [DMEM] que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina). Incube en un incubador humedecido a 37 °C y 5% de CO2 hasta que las células alcancen una confluencia del 80 - 100%.
- Infecte las células con MP-12 a una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Incluya al menos dos pocillos no infectados: uno de ellos servirá como control no infectado, y el otro será tratado con actinomicina D (ActD). Retire el medio de crecimiento y diluya el stock del virus de modo que el volumen total añadido a cada pocillo sea de 400 μL. Incube durante 1 h en un incubador humedecido a 37 °C y 5% de CO2.
- Retire el inóculo y añada 2 mL de medio de crecimiento fresco por pocillo. Incube a 37 °C durante 12 h.
NOTA: Si adapta este protocolo para usarlo con otro virus, es recomendable realizar un experimento de curso temporal para determinar el punto óptimo de tiempo para la marcación y recolección. Organice este curso temporal de manera que los tiempos de infección estén escalonados y todas las muestras puedan marcarse, recolectarse y teñirse al mismo tiempo.
- A las 12 horas post-infección (hpi), sustituya el medio de crecimiento por un medio que contenga 0,5 mM de EU. A uno de los pocillos mock-infectados, añada también 5 μg/mL de ActD. Este servirá como control de supresión transcripcional, ya que la ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente del ADN. Devuelva las células al incubador.
- A las 13 hpi, lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y recójalas mediante tripsinización. Lave las células recolectadas tres veces con PBS que contenga 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
NOTA: Durante este y los pasos subsiguientes, no centrifugue las células a más de 500-1.000 x g para evitar la rotura celular. Centrifugue las células durante 1-2 min para sedimentarlas.
NOTA: Si se planea una inmunotinción de superficie tras la reacción de tipo "click", recoja las células usando un raspador de goma ("rubber policeman") o un raspador celular desechable.
- Fije las células resuspendiéndolas en 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) e incube durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Lave una vez con 1 mL de PBS-EDTA por pocillo. Continúe inmediatamente con el paso 2.
NOTA: Es importante continuar inmediatamente con la reacción de tipo "click", ya que el ARN se degrada si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados. De forma similar, si realiza un experimento de curso temporal, asegúrese de marcar, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo.
Reacción de tipo "click" para detectar el ARN marcado
- Permeabilice las células añadiendo 1 mL de Triton X-100 al 0,2% en PBS. Incube durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 2.1 a 2.3 deben ser libres de nucleasas.
- Lave tres veces con 1 mL de PBS por pocillo.
- Retire los cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y transfiéralos a una cámara húmeda. Cubra cada cubreobjeto con 50 - 100 μL de solución de tinción de tipo "click" (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 20 μM de azida fluorescente [máximo de excitación/emisión: 590/617 nm], 100 mM ácido ascórbico). Incube durante 1 h a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
NOTA: Para armar la cámara húmeda, forre el fondo de una placa de cultivo celular o de una placa de Petri de 10 cm de diámetro con una película de parafina plástica. Forre el interior del borde del recipiente con toallas de papel húmedas. Coloque los cubreobjetos sobre la película de parafina plástica.
NOTA: Tenga cuidado de que los cubreobjetos no se sequen durante este o cualquier otro paso del protocolo. Lo mejor es añadir la solución de tinción a cada cubreobjeto inmediatamente después de colocarlo en la cámara húmeda.
NOTA: Prepare la solución de tinción de tipo "click" fresca inmediatamente antes de este paso. Las soluciones stock de Tris 1,5 M pH 8,5, CuSO4 100 mM y ácido ascórbico 500 mM pueden almacenarse a 4 °C. Sin embargo, deseche cualquier solución stock de ácido ascórbico que haya adquirido color amarillo.
NOTA: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que sea compatible con los filtros de su microscopio de fluorescencia.
- Retire los cubreobjetos de la cámara húmeda y colóquelos en una placa de 12 pocillos nueva, y lávelos tres veces con 1 mL de PBS por pocillo.
- Monte los cubreobjetos colocando una gota (aproximadamente 15 μL) de Fluoromount-G sobre una portaobjetos. Sumerja el cubreobjeto en H2O, elimine el exceso de H2O tocando el borde con una toalla de papel y coloque el cubreobjeto con la cara celular hacia abajo sobre la gota de Fluoromount-G. Deje secar al aire durante 5 min.
NOTA: Si va a realizar imágenes con un microscopio invertido, permita que el Fluoromount-G se solidifique a 4 °C durante la noche o fije los cubreobjetos al portaobjetos sellando los bordes con esmalte de uñas transparente.
NOTA: Las preparaciones pueden observarse inmediatamente o almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante hasta una semana.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-Etinoxil uridina | Berry Associates | PY 7563 | Disolver en DMSO para obtener una solución madre de 100 mM |
| Cubreobjetos redondo de 12 mm | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Actinomicina D (ActD) | Sigma | 9415 | Disolver en DMSO para obtener una solución madre de 10 mM |
| Microscopio de fluorescencia | por ejemplo, Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | Disolver en H₂O para obtener una solución madre de 100 mM |
| DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) | Invitrogen | 11965092 | |
| Suero bovino fetal (FBS) | Invitrogen | 16000044 | |
| Azida fluorescente (acoplada a Alexa Fluor 594) | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A-5960 | Disolver en H₂O para obtener una concentración de 500 mM |
| Paraformaldehído | Sigma | 158127 | |
| Penicilina-Estrepotomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Tritón X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Base de Trizma | Sigma | T-1503 | disolver en H₂O para obtener una solución madre de 1,5 M, pH 8,5 |
