Análisis de la supresión transcripcional del huésped inducida por virus mediante citometría de flujo

Resumen

Fuente: Kalveram, B., et al. Uso de la química click para medir el efecto de la infección viral en la síntesis de ARN de la célula huésped. J. Vis. Exp. (2013)

Este video demuestra el uso de la química click y la citometría de flujo para medir la supresión inducida por virus en la transcripción de la célula huésped. Las células de mamífero se infectan con un virus que expresa una proteína de virulencia nuclear que interrumpe el complejo del factor de transcripción del huésped, mientras que las células de control permanecen activas transcripcionalmente. La incorporación de 5-etiniluridina marca el ARNm recién sintetizado, permitiendo la cuantificación de la actividad transcripcional en células infectadas y de control mediante detección de doble fluorescencia.

Protocolo

1. Infectar células con MP-12 y marcar el ARN recién sintetizado con 5-etiniluridina (EU)

1. Siembre células 293 en una placa de cultivo celular de 6 pocillos con medio de crecimiento (DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina). Incube en un incubador humedecido a 37 °C y 5% de CO₂ hasta que las células alcancen una confluencia del 80 al 100%.
2. Infecte las células con MP-12 a una m.o.i. de 3. Incluya al menos dos pocillos no infectados: uno de los dos servirá como control no infectado, y el otro será tratado con ActD en el paso 1.4. Retire el medio de crecimiento y diluya el stock de virus de modo que el volumen total añadido a cada pocillo sea de 400 μl. Incube durante 1 hora en un incubador humedecido a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Retire el inóculo y añada 2 ml de medio de crecimiento fresco por pocillo. Incube a 37 °C durante 12 horas.

NOTA: Si se adapta este protocolo para su uso con otro virus, es recomendable realizar un experimento de curso temporal para determinar el punto óptimo de tiempo para la marcación y la recolección. Configure este curso temporal de manera que los tiempos de infección estén escalonados y todas las muestras puedan marcarse, recolectarse y teñirse al mismo tiempo.

4. A las 12 h.p.i., reemplace el medio de crecimiento con un medio que contenga 0,5 mM de EU. A uno de los pozos infectados simuladamente, agregue también 5 μg/ml de ActD. Esto servirá como control para la supresión transcripcional, ya que la ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente del ADN. Devuelva las células al incubador.
5. A las 13 h.p.i., lave las células una vez con PBS y recójalas mediante tripsinización. Lave las células recogidas tres veces con PBS que contenga 1 mM de EDTA (PBS-EDTA).

NOTA: Durante este y los pasos posteriores, no centrifugar las células a más de 500 - 1.000 x g para evitar la ruptura celular. Centrifugar las células durante 1-2 min para sedimentarlas.

NOTA: Si se planea una inmunotinción de superficie después de la reacción de click, recoger mediante un raspador de goma o un raspador de células desechable en su lugar.

6. Fije las células resuspendiéndolas en 1 ml de PFA al 4% e incube durante 30 min a temperatura ambiente.
7. Lave una vez con 1 ml de PBS-EDTA por pocillo. Continúe inmediatamente con el paso 6.

NOTA: Es importante proceder inmediatamente con la reacción de click, ya que el ARN se degrada si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados. De manera similar, si se realiza un experimento de curso temporal, asegúrese de etiquetar, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo.

2. Reacción de click para detectar ARN marcado

1. Permeabilice las células resuspendiéndolas en 0,5 ml de Triton X-100 al 0,2% en PBS. Incube durante 10 min a temperatura ambiente.

NOTA: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 2.1 a 2.3 deben estar libres de nucleasas. Si las células no sedimentan adecuadamente durante este paso, aumente el tiempo de centrifugación a 5 min. El comportamiento de sedimentación mejorará una vez que las células se suspendan en el tampón FACS.

2. Lave una vez con 1 ml de PBS.

NOTA: No utilice EDTA en este paso, ya que esto quelará los iones Cu²⁺ necesarios para la reacción de click.

3. ReSuspender las células en 200 μl de solución de tinción click (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 200nM azida marcada con colorante fluorescente [máximo de excitación/emisión: 650/665 nm], 100 mM ácido ascórbico). Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.

NOTA: Prepare la solución de tinción con reacción tipo click fresca inmediatamente antes de este paso. Las soluciones stock de Tris 1,5 M pH 8,5, CuSO₄ 100 mM y ácido ascórbico 500 mM pueden almacenarse a 4 °C. Sin embargo, deseche cualquier solución stock de ácido ascórbico que haya adquirido un color amarillo. Si las células se agrupan durante este paso, resuspenda pipeteando arriba y abajo varias veces. Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que pueda detectarse mediante su citómetro de flujo. Prepare también una muestra de células infectadas que no se someta al procedimiento de tinción tipo click; estas serán necesarias para la calibración del citómetro de flujo. Puede utilizar la mitad de las células infectadas o incluir una poceta adicional infectada en el paso 1,2.

Lave dos veces con tampón FACS (PBS que contiene 1 mM de EDTA y 0,5 % (p/v) de BSA).

3. Inmunofluorescencia para detectar la expresión de proteínas virales

1. ReSuspender las células en 200 μl de anticuerpo primario (anti-RVFV) diluido en tampón FACS (1:10,000) e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.

NOTA: Alternativamente, este paso puede realizarse durante la noche a 4 °C en la oscuridad.

NOTA: Prepare también una muestra de células no infectadas que se sometieron al procedimiento de tinción por reacción de "click" pero que no serán inmunomarcadas; estas serán necesarias para la calibración del citómetro de flujo. Puede utilizar la mitad de las células simuladas infectadas o incluir un pocillo adicional no infectado en el paso 1.2.

NOTA: Al adaptar este protocolo para su uso con un virus diferente, determine primero la dilución óptima para su anticuerpo primario.

2. Lave las células dos veces con el tampón FACS.
3. Reuspenda las células en 200 μl de anticuerpo secundario (inmunoglobulina G anti-ratón conjugada con un colorante fluorescente [máximo de excitación/emisión: 495/519 nm]) diluido en tampón FACS (1:1,000) e incube durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Lave las células una vez con el tampón FACS.

NOTA: En este momento, las células pueden almacenarse durante la noche a 4 °C en la oscuridad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-etinil-uridina	Berry Associates	PY 7563	disolver en DMSO para obtener un stock de 100 mM
cubrebjetes redondos de 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
tubos de poliestireno de 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomicina D (ActD)	Sigma	9415	disolver en DMSO para obtener un stock de 10 mM
Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de ratón	Invitrogen	A-11029
Albúmina sérica bovina (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	disolver en H2O para obtener un stock de 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	disolver en H2O para obtener un stock de 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
azida fluorescente (acoplada a Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
azida fluorescente (acoplada a Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
ácido L-ascórbico	Sigma	A-5960	disolver en H2O para obtener una concentración de 500 mM
filtro de papel	VWRbrand	28333-087
paraformaldehído	Sigma	158127
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen	15140122
poli-L-lisina (PM ≥ 70000)	Sigma	P1274
Tritón X-100	Sigma	T-8787
base de Trizma	Sigma	T-1503	disolver en H2O para obtener un stock de 1,5 M, pH 8,5
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200056
Microscopio de fluorescencia			por ejemplo, Olympus IX71
Citómetro de flujo			por ejemplo, BD Biosciences LSRII Fortessa