Producción de partículas retrovirales para la transferencia de genes

Resumen

Fuente: Zjablovskaja, P., et al., Proliferación y Diferenciación de Células Precursoras Mieloides Murinas 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la producción de partículas retrovirales recombinantes mediante la transfección de células empaquetadoras derivadas de riñón humano, lo que permite la entrega estable de genes a células diana para aplicaciones posteriores, como la modificación genética, ensayos funcionales o estudios de diferenciación celular.

Protocolo

1. Producción de retrovirus
   1. Siembre una suspensión simple de células Bosc23 (6 × 10⁶) en una placa de Petri de 16 cm y cultive en 18 mL de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) que contenga 10 % de FBS (suero bovino fetal) hasta que la confluencia del cultivo alcance el 80 % (24 h).
      NOTA: Las células deben crecer en monocapa y no formar agregados en cultivo. El recuento celular puede realizarse mediante diferentes métodos (válido para el resto de los protocolos presentados aquí). En caso de un número bajo de muestras, se recomienda el recuento manual al microscopio utilizando la cámara de Bürker. En este caso, utilice azul de tripano para la exclusión de células muertas. Mezcle las células 1:1 con azul de tripano al 0,4 % en PBS (solución salina tamponada con fosfato). Para realizar el recuento de un gran número de muestras, puede emplearse un contador celular automático.
   2. Combine 40 µg de un constructo retroviral (como MSCV), 20 µg de pCL-Eco (vector de empaquetamiento), 80 µl de PEI (polietilenimina) y 2 mL de medio con suero reducido (por ejemplo, Opti-MEM (medio mínimo esencial) (sin antibióticos). Incube esta mezcla durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Reemplace cuidadosamente el medio de las células Bosc23 con 16 mL de DMEM suplementado con 2 % de FBS. Precaliente el medio a 37 °C antes de usarlo.
      NOTA: No use antibióticos durante la transfección, ya que podrían reducir la eficiencia de transfección.
   4. Añada la mezcla preparada en el paso 1.2 gota a gota y con cuidado al cultivo de Bosc23, e incube durante 4 h a 37 °C. Limite la incubación a menos de 6 h debido a la toxicidad del PEI.
   5. Después de la incubación, cambie el medio de las células Bosc23 a 18 mL de DMEM precalentado que contenga 10 % de FBS, y cultive las células durante 48 h a 37 °C. Coloque las placas en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 y siga los procedimientos estándar de seguridad.
   6. Recoja el medio de Bosc23 (que contiene partículas retrovirales ecotrópicas) utilizando una pipeta serológica de 25 mL en un tubo cónico de 50 mL, y almacénelo a 4 °C.
      NOTA: (Importante) La eficiencia de transfección debe alcanzar el 90 % para producir un virus de alto título.
   7. Añada 18 mL de DMEM con 10 % de FBS precalentado a las células Bosc23 y cultive durante 24 h.
   8. Repita el paso 1.6.
      NOTA: Los sobrenadantes retrovirales de los pasos 1.6 y 1.8 pueden combinarse una vez que alcancen la misma temperatura (4 °C) para preservar la integridad viral.
   9. Para evitar la contaminación de Bosc23 en los sobrenadantes virales, centrifugue el virus recolectado a 1500 × g durante 10 min a 4 °C. Aliquote el virus, congélelo rápidamente utilizando hielo seco o nitrógeno líquido y almacénelo a -80 °C. Sin embargo, tenga en cuenta que el virus recién preparado presenta una mayor calidad en términos de eficiencia de infección que los lotes congelados.
      NOTA: (Importante) Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación del virus, ya que provocan su degradación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Medio con suero reducido	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamina, Rojo fenol
Suero bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Utilizado para el cultivo de células HEK293T, NIH3T3, BOSC23
Penicilina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Estreptomicina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Polvo de sal sulfato de estreptomicina
Gentamicina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polietilenimina	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Lineal, PM 25.000 (PEI 25000)