Generación del virus sincitial respiratorio recombinante marcado con GFP mediante un sistema de expresión T7

Resumen

Fuente: Bouillier, C. et. al., Amplificación y Titulación de Virus Sincitial Respiratorio Recombinantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la generación de un virus sincitial respiratorio recombinante que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) mediante un sistema de genética inversa basado en T7. La co-transfección de plásmidos que codifican proteínas virales y un genoma marcado con GFP conduce a la expresión de proteínas e inicia el rescate del virus.

Protocolo

1. Aislamiento y primer pase del virus recombinante

NOTA: Realice todos los siguientes pasos en un ambiente estéril, utilizando una cabina de seguridad de clase II.

1. El día anterior a la transfección, prepare una suspensión de la línea celular BSRT7/5 a 5 x 10⁵ células/mL en medio completo. Distribuya 2 mL de suspensión celular por pocillo en una placa de 6 pocillos. Prepare un pocillo por cada virus que se vaya a rescatar y un pocillo adicional para un control negativo. Incube la placa a 37 °C y 5% CO₂. Verifique que las células presenten una confluencia del 80% al 90% al día siguiente.
2. Descongele los vectores de virus sincitial respiratorio (RSV) de genética inversa p-RSV-GFP y p-RSV-M2-1-GFP, así como p-N, p-P, p-L y p-M2-1. Mezcle, para cada virus a rescatar, 1 µg de p-N y p-P, 0,5 µg de p-L, 0,25 µg de p-M2-1 y 1,25 µg de p-RSV (GFP o M2-1 GFP) en un tubo.
   NOTA: Pueden utilizarse diferentes vectores de expresión para las proteínas virales del complejo de la polimerasa (N, P, L y M2-1); sin embargo, debe mantenerse la proporción entre las proteínas. Realice el control negativo sustituyendo el vector p-RSV por un vector vacío.
3. Proceda a la transfección (véase la Tabla de Materiales).
   1. Añada 250 µL de medio con suero reducido a los vectores mezclados. En otro tubo, diluya 10 µL del reactivo de transfección en 250 µL de medio con suero reducido. Vortexe suavemente ambos tubos y espere 5 min. Mezcle el contenido de ambos tubos y espere 20 min a temperatura ambiente.
   2. Lave las células BSRT7/5 con 1 mL de medio con suero reducido y distribuya 1,5 mL de medio esencial mínimo (MEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS) sin antibióticos por pocillo. Si es necesario, incube a 37 °C y 5% CO₂ hasta que finalice la incubación descrita en el paso 1.3.1.
   3. Añada 500 µL de la mezcla de transfección preparada en el paso 1.3.1 a un pocillo cuando haya transcurrido el tiempo de incubación de 20 min. Coloque las células en el incubador a 37 °C y 5% CO₂ durante 3 días. No cambie el medio de cultivo de las células durante la transfección.
4. Observe la fluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP) (excitación a 488 nm y emisión a 515–535 nm) mediante un microscopio de fluorescencia invertido con aumento de 20x una vez al día para monitorear la eficiencia del rescate, utilizando el filtro GFP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BSRT7/5		no disponible comercialmente	Ver referencia 22. Buchholz et al. 1999
Microscopio de fluorescencia para observaciones	Olympus	IX73 Olympus microscope
Microscopio de fluorescencia para videomicroscopía	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5%	Sigma	H3375
L-Glutamina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Reactivo Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	El protocolo en el paso 2.3. está optimizado para este reactivo.
MEM (10x), sin glutamina	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99,5%	Sigma	M7506
Medio suero reducido Opti-MEM I	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plásmidos		no disponible comercialmente	Ver referencia 21. Rameix-Welti et al. 2014