Ensayo de titulación por placas para la cuantificación del virus sincitial respiratorio infeccioso

Resumen

Fuente: Bouillier, C., et al. Generación, amplificación y titulación de virus sincitial respiratorio recombinantes. J. Vis. Exp. (2019)

El video demuestra un ensayo de titulación por placas utilizado para cuantificar el virus respiratorio sincitial recombinante infeccioso (RSV) en monocapas de células epiteliales. Se muestra la infección de células huésped con suspensiones virales diluidas en serie, la restricción de la diseminación viral mediante una capa superior semisólida a base de celulosa y la formación de placas localizadas derivadas de los efectos citopáticos. El procedimiento concluye con la tinción, descontaminación y conteo de placas para determinar el título viral y evaluar la infectividad del RSV.

Protocolo

1. Ensayo de titulación por placas

1. Prepare placas de 12 pocillos para la titulación el día anterior a la realización del ensayo de titulación (se necesitarán seis pocillos para titular un tubo de virus). Siembre los pocillos con 1 mL de células epiteliales humanas de tipo 2 (HEp-2) a 5 × 10⁵ células/mL en medio completo.
2. Al día siguiente, prepare una suspensión estéril de celulosa microcristalina (2,4 % [p/v] en agua) (consulte la tabla de materiales).
   1. Dispersar 2,4 g de polvo de celulosa microcristalina en 100 mL de agua destilada, utilizando un agitador magnético estándar, hasta la disolución completa del polvo (generalmente 4–12 h). Autoclavar la suspensión a 121 °C durante 20 min y almacénelo a temperatura ambiente antes del uso.
      NOTA: Bajo tales condiciones, la suspensión es estable durante 1 año.
   2. Después de abrir la solución en un ambiente estéril, almacénela a 4 °C durante 6 meses. Agite siempre la suspensión antes de usarla (agitando manualmente o en vórtex) para asegurar que esté homogénea.
3. Preparar el 2× medios esenciales mínimos (MEM) en un ambiente estéril. Diluir el MEM comercial 10× con agua estéril y agregue L-glutamina, 1.000 unidades/mL de penicilina y 1 mg/mL de estreptomicina. Agite la dilución vigorosamente y almacénela a 4 °C.
   NOTA: Realice los pasos 1.4–1.10 en un ambiente estéril utilizando una cabina de seguridad de clase II.
4. Preparar seis tubos que contengan 900 µL de MEM sin suero de feto bovino (FCS) por virus a titular (los tubos de titulación). Descongele las alícuotas del virus, vortexéelas vigorosamente durante 5 s y transfiéralas 100 µL al primer tubo de titulación.
5. Realice una dilución en serie de diez×, como sigue. Añada 100 μL de virus a 900 μL de medio en el primer tubo, coloque la tapa en el tubo y mezcle su contenido mediante vortex durante unos segundos. Cambie la punta en la pipeta, agregue 100 µL de la primera dilución a 900 µL del medio en el segundo tubo, coloque la tapa en el tubo y vortexee. Repita el procedimiento hasta el sexto tubo.
   NOTA: Es muy importante cambiar la punta para cada dilución.
6. Escriba el nombre del virus y las diluciones en factores sobre las placas de 12 pocillos HEp-2. Agregue una marca para asociar cada placa con su tapa, ya que pueden separarse durante la tinción (paso 1.9). Retire el medio de las placas y distribuya 400 µL de una dilución por pocillo. Incubar las placas a 37 °C durante 2 h, para la adsorción del virus.
   NOTA: Cambie la punta de la pipeta entre cada inóculo o proceda de la concentración más baja a la más alta con la misma punta. Inocule una serie limitada de placas (1 a 2) simultáneamente para evitar que las células se sequen.
7. Preparar el recubrimiento de celulosa microcristalina durante la adsorción del virus (preparación extemporánea). Para obtener 100 mL de recubrimiento, mezclar 10 mL de suspensión de celulosa microcristalina al 2,4 %, 10 mL de 2× MEM, y 80 mL de MEM con 2% de SFC.
   1. Ajuste el pH del 2× Ajustar el MEM a aproximadamente 7,2 con una solución estéril de bicarbonato de sodio al 7,5 %, siguiendo el indicador de color. Añadir la suspensión de celulosa microcristalina y el MEM, y mezclar vigorosamente.
8. Al finalizar la incubación de 2 h, añada 2 a 3 mL de recubrimiento a cada pocillo de las placas de 12 pocillos sin eliminar el inóculo. Tenga cuidado de evitar la contaminación de los pocillos adyacentes con inóculos de alto título viral. Incube la placa a 37 °C y 5% CO₂₂ durante 6 días. No mueva la placa ni el incubador durante la incubación.
9. Proceda a teñir las células utilizando solución de violeta de cristal (8% violeta de cristal [v/v], 2% formaldehído [v/v] y 20% etanol [v/v] en agua).
   1. Proteja la superficie de trabajo de la cabina de seguridad biológica con una hoja (el violeta de cristal tiñe fuertemente las superficies).
   2. Agite suavemente las placas para retirar la capa superior de celulosa microcristalina. Retire los sobrenadantes y lave las células 2 veces con PBS.× con 1× salina tamponada con fosfato (PBS). Manipule las placas una por una para evitar que las células se sequen. Añada 1–2 mL de la solución de violeta de cristal y espere entre 10 y 15 minutos. Retire la solución, que puede reutilizarse para la tinción de placas posteriores.
   3. Sumerja las placas y sus tapas en lejía fresca durante unos segundos y, luego, lávelas cuidadosamente con agua del grifo. Tenga en cuenta que las placas y las cubiertas quedan descontaminadas mediante la lejía.
   4. Coloque las placas y sus tapas sobre toallas de papel y déjelas secar. Seque las placas a temperatura ambiente tras el enjuague con agua y almacénelas a temperatura ambiente. Para períodos largos de almacenamiento (meses), mantenga las placas protegidas de la luz para preservar el color. Tenga en cuenta que si las células pierden su coloración, pueden volver a teñirse con violeta de cristal.
10. Calcule los títulos virales. Cuente las placas en los pocillos de las placas secas, que son visibles a simple vista. Verifique que el número de placas de las diferentes diluciones sea coherente (factor 10 entre cada dilución). Elija el pocillo en el que las placas sean más fáciles de contar. Determine el número de placas en relación con el volumen del inóculo y la dilución.
    NOTA: En el ejemplo proporcionado en Figura 1, se cuentan 21 placas en la dilución 10^-5 dilución. Estos valores corresponden a una título de

Resultados

Figura 1: Determinación del título de RSV mediante el ensayo de placas. (A) Resultados del ensayo de titulación por placas en una placa de 12 pocillos. Se muestran los seis pocillos infectados con diluciones en serie de un stock viral. Las diluciones se indican en logaritmo base 10. Todas las células infectadas con las tres primeras diluciones están desprendidas. El número de placas observado con las diluciones de 10^-4, 10^-5 y 10^-6 es consistente. (B) Ilustración del conteo de placas (números amarillos). La estrella verde indica rayones en la capa celular.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de violeta de cristal	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), sin glutamina	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Solución de bicarbonato de sodio al 7,5 %	ThermoFisher Scientific	25080094
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122