Evaluación de la capacidad de replicación viral mediante un ensayo de transcriptasa inversa radiomarcado

Resumen

Fuente: Claiborne, D. T. et al. Un Método de Clonación Basado en Enzimas de Restricción para Evaluar la Capacidad de Replicación In vitro de Virus Quiméricos de Gag-MJ4 del VIH-1 Subtipo C. J. Vis. Exp. (2014)

Este video demuestra la evaluación de la capacidad de replicación viral mediante un ensayo de transcriptasa inversa marcado con radioisótopos. Se añaden sobrenadantes de cultivo que contienen viriones progenie a una mezcla de transcripción inversa que contiene un nucleótido marcado radiactivamente. La señal incorporada refleja el rendimiento viral y la eficiencia de replicación. Se utiliza la imagen por fósforo para detectar y comparar las señales entre las muestras de prueba y las muestras de tipo salvaje.

Protocolo

1. Análisis de la transcriptasa inversa (RT) en sobrenadantes de cultivo celular

1. Configure una campana de seguridad biológica en una instalación de nivel de seguridad biológica 3 (BSL-3) para su uso con materiales radiactivos.
   1. Coloque papel absorbente dentro de la campana y sustituya el aspirador por uno designado para uso con material radiactivo. 
      NOTA: Todos los desechos radiactivos deben eliminarse adecuadamente de acuerdo con las regulaciones de seguridad.
2. Añada 1-2 µl de [α-³³P] desoxitimidina trifosfato (dTTP) al 10 mCi/ml y 4 µl de ditiotreitol (DTT) al 1 M a cada alícuota de 1 ml de la mezcla maestra de RT (véase Tabla 1).
3. Mezcle cuidadosamente cada tubo microcentrífugo de 1,5 ml que contenga la mezcla maestra de RT, DTT y [α-³³P] dTTP con una pipeta de 1.000 µl y transfiera a una cubeta estéril.
4. Dispense 25 µl de la mezcla de RT marcada en cada pocillo de una placa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 96 pocillos con paredes delgadas. 
   NOTA: Incluya espacio para un control positivo (infección con tipo silvestre (WT) MJ4) y un control negativo (infección simulada).
5. Añada 5 µl de cada sobrenadante a la placa de PCR que contiene la mezcla maestra de RT.
6. Selle la placa de PCR con una cubierta de lámina adhesiva e incube durante 2 h a 37 °C en un termociclador. Por razones de seguridad, enjuague las puntas de pipeta con Amphyl y deseche las puntas en un recipiente pequeño que contenga residuos de Amphyl, los cuales posteriormente se eliminarán como desecho radiactivo.
7. Después de la incubación, haga pequeños orificios en la cubierta de lámina usando una pipeta multicanal de 200 µl. 
   NOTA: Si las puntas de pipeta tocan el líquido en el pocillo, reemplace las puntas antes de pasar a la siguiente columna o fila.
8. Mezcle las muestras 5 veces y transfiera 5 µl de cada muestra al papel DE-81. Deje secar al aire durante 10 min.
9. Lave los revelados 5 veces con solución salina-citrato sódico (SSC) 1x y luego 2 veces con etanol al 90 %, durante 5 min por lavado. Permita que sequen al aire.
   1. Coloque cada revelado en un recipiente de lavado separado, como una caja de almacenamiento tipo sándwich, añada suficiente tampón de lavado (SSC 1x o etanol al 90 % (EtOH)) para cubrir el revelado y agite durante 5 min.
   2. Vierta el tampón de lavado en un recipiente aparte y repita. NOTA: Los primeros 3 lavados se consideran radiactivos y deben eliminarse adecuadamente. Los últimos 2 lavados pueden eliminarse de forma convencional.
10. Una vez secos, envuelva cuidadosamente el revelado en papel plástico transparente y expóngalo a una pantalla fosforescente en una caja herméticamente sellada durante la noche a temperatura ambiente.
11. Analice las pantallas fosforescentes con un fosforimager y cuantifique los transcritos radiactivos.
12. Dibuje un círculo alrededor de cada señal radiactiva utilizando el software OptiQuant. Represente gráficamente los valores de Unidad de Luz Digital (DLU) para generar curvas de replicación.
13. Para generar las puntuaciones de capacidad de replicación, los valores de DLU se transformaron mediante log₁₀, y las pendientes se calcularon utilizando los puntos temporales de los días 2, 4 y 6. Las pendientes de replicación luego se dividieron por la pendiente del MJ4 tipo silvestre (WT) para obtener las puntuaciones de capacidad de replicación. Es importante normalizar en función de los valores de MJ4 WT obtenidos de la misma placa de RT para reducir la variabilidad intraensayo.

Tabla 1: Receta para la mezcla maestra del ensayo de transcriptasa inversa marcada con radioisótopos.
NOTA: Almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 °C.

Reactivo	Volumen (ml)
H2O libre de nucleasas	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
Cloruro de potasio (1 M)	37.5
Cloruro de magnesio (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 M)	1.02
Ácido poliadenílico, sal potásica (2 mg/ml)	1.25
Primer oligo-dT (25 μg/ml)	3.25
Volumen total	500

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos para cultivo celular
Desinfectante/limpiador Amphyl	Fisher	22-030-394
Bandejas de depósito para multicanal, 55 ml	Fisher	13-681-501
Solución de cloruro de magnesio 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Reactivos para el ensayo de cuantificación de transcriptasa inversa
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
Tris-Cl 1 M, pH 8,0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Debe ajustarse a pH 7,8 con KOH
Cloruro de potasio (KCl) 2 M	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Ajustar a solución 1 M
EDTA 0,5 M	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Sal potásica de ácido poliadenílico (Poly rA)	Midland Reagent Co.	P-3001
Primer oligo d(T)	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
Pantalla de fósforo de superresolución SR, pequeña	Perkin-Elmer	7001485
Placa de 96 pocillos Corning Costar Thermowell, modelo (M), policarbonato	Fisher	07-200-245	Manufacturado por Corning Life
Cinta de sellado de aluminio para microplaca de 96 pocillos Corning, no estéril	Fisher	07-200-684	Manufacturado por Corning Life
Papel de intercambio aniónico DE-81	Whatman	3658-915
Citrato de sodio dihidratado	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Cloruro de sodio	Fisher	S671-3
Cassette para auto radiografía	Fisher	FB-CA-810
Pantalla de fósforo para almacenamiento Cyclone	Packard
Ciclador térmico, PTC-200	MJ Research