Preparación de muestras para la cuantificación viral basada en luciferasa

Resumen

Fuente: Garcia, V., et al. Titulación de alto rendimiento de virus recombinantes que expresan luciferasa. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Este video demuestra la preparación de muestras de cultivo celular para evaluar la carga viral utilizando un ensayo basado en luciferasa. Se describe el proceso de infectar células epiteliales con un virus modificado genéticamente, transferir sobrenadantes virales y estándares a los pocillos del ensayo, y favorecer la entrada viral mediante centrifugación e incubación. La expresión de luciferasa sirve como reportero, permitiendo la cuantificación de la concentración viral basada en la emisión de señal luminiscente.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Obtenga muestras que contengan virus que expresan luciferasa (en este caso, VSV∆51-Fluc como ejemplo) para la titulación y transfiéralas a placas de 96 pocillos. Alternativamente, realice infecciones en placas de cultivo celular de 96 pocillos y use los sobrenadantes directamente.
2. Deje dos columnas sin tratar para incluir las curvas estándar. Para experimentos realizados directamente en placas de 96 pocillos, determine el título al final del experimento (40 horas postinfección) o almacene a -80 °C y determine el título en una fecha posterior.

2. Preparación de Células Permisionarias para la Titulación del Virus

1. 24 horas antes de la titulación, prepare una suspensión de células Vero a una concentración de 2,5 x 10⁵ células/ml en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenga 10 % de suero bovino fetal (FBS), 30 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y 1 % de penicilina/estreptomicina. 
   NOTA: Aunque este protocolo utiliza células Vero, se podría usar cualquier línea celular permisiva adecuada para la infección por el virus de la estomatitis vesicular (VSV).
2. Siembre 2,5 x 10⁴ células (100 μl) en placas blancas sólidas de fondo plano de 96 pocillos utilizando un dispensador de microplacas.
   1. Prepare 12 ml de suspensión celular por placa, más 5 ml adicionales para cebado.
   2. Limpie el cartucho del dispensador de microplacas enjuagando los tubos con 50 ml de agua estéril.
   3. Llene las líneas del dispensador de microplacas con la suspensión celular y deje pasar 5 ml de la suspensión a través del sistema.
   4. Seleccione un programa que dispensará 100 μl en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con paredes blancas. Realice la dispensación y repita según sea necesario para placas adicionales. Además, siembre algunos pocillos en una placa de 96 pocillos transparente de fondo plano si se utilizan placas de fondo opaco con paredes blancas, para verificar la salud y densidad celular.
   5. Al finalizar, devuelva las células al recipiente original. Limpie el cartucho pasando 50 ml de etanol al 70 %, seguido de 50 ml de agua estéril tibia a través de los tubos.
   6. Asegúrese de que el cartucho y los tubos se limpien adecuadamente entre usos.
3. Incube las células durante 24 horas a 37 °C en un incubador humedecido con 5 % de CO₂.

3. Preparación de la curva estándar viral

1. Prepare una curva patrón de VSV∆51-Fluc en DMEM sin suero de modo que la concentración final de unidades formadoras de placas (pfu) por ml después de la transferencia a las células Vero sea la siguiente: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml y 10¹ pfu/ml. Prepare 50 μl de cada concentración por placa de células Vero más un 10 % adicional.
   NOTA: Será necesario evaluar el título del stock del virus luciferasa de forma clásica para generar una curva patrón que permita la cuantificación absoluta. De lo contrario, puede lograrse una cuantificación relativa sin información precisa del título mediante el establecimiento arbitrario del título viral según los pasos de dilución. Por ejemplo, la primera dilución de la curva patrón puede fijarse en 10⁸ unidades virales, y la siguiente dilución 1/10 en 10⁷, y así sucesivamente. En este contexto, los valores deben expresarse como un cambio en la cantidad en comparación con una muestra predeterminada, ya que la cuantificación absoluta no será precisa.

4. Transferencia de los sobrenadantes de muestra sobre células permisivas

1. Verifique las células Vero sembradas en la placa de 96 pocillos con fondo transparente bajo un microscopio óptico para confirmar que las monocapas tengan al menos un 95 % de confluencia.
2. Transfiera 25 μl del sobrenadante de la muestra a las células Vero sembradas en placas con paredes blancas. No transfiera los sobrenadantes a las 2 columnas designadas para las curvas patrón. 
   NOTA: Esto puede hacerse simultáneamente en todos los pocillos de una sola placa utilizando un dispensador automático de 96 canales.
3. Utilizando una pipeta multicanal de 8 o 12 canales, añada 25 μl de cada dilución de la curva patrón preparada en el paso 3 a las células Vero en las 2 columnas designadas.
4. Centrifugue las placas durante 5 min a 430 x g a temperatura ambiente (RT).
5. Incube durante 5 h a 37 °C en un incubador humedecido con 5 % de CO₂.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Corning	SH30243.01
Suero bovino fetal	NorthBio Inc.	NBSF-701
Solución salina tamponada con fosfatos	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Preparar una solución 1 mM, pH 7,3
Placas microtituladoras de poliestireno tratadas para cultivo celular, de fondo plano blanco sólido, de 96 pocillos	Corning	3917	Las placas de 384 pocillos también pueden utilizarse para un mayor rendimiento
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Lector de placas con monocromador
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Sistema manual de pipeteo de 96 puntas
Puntas esterilizadas con filtro para Liquidator96 LTS	Mettler Toledo	LQR-200F	Cualquier punta filtrada estéril compatible con los pipetadores elegidos es adecuada
Microflo	BioTek	111-206-21	Utilizado para sembrar células en una placa de 96 pocillos
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Fluorímetro de placas