Generación de células madre embrionarias de ratón infectadas con lentivirus

Resumen

Fuente: Chiarella, A. M. et. al., Represión de la transcripción génica mediante la redirección de la maquinaria celular con modificadores epigenéticos químicos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la generación de células madre embrionarias de ratón modificadas genéticamente mediante la transducción con lentivirus. Las partículas lentivirales entregan un marcador de resistencia a antibióticos, lo que permite la integración genómica estable y la selección de células transducidas.

Protocolo

1. Infección de células madre embrionarias de ratón (mESC) con lentivirus

1. Cultive células madre embrionarias de ratón (mESC) de bajo pase (menos de pase 35), adaptadas al ensayo de cromatina in vivo (CiA), en medio base de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con alta glucosa, suplementado con 20% de suero bovino fetal (FBS) de calidad para células madre embrionarias, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 1x aminoácidos no esenciales (NEAA), Pen/Strep, 2-mercaptoetanol y factor inhibidor de la leucemia (LIF) en una dilución de 1:500, en un incubador a 37 °C con 5% de CO₂.
   NOTA: El LIF se obtiene del sobrenadante de células Cos productoras de Lif-1C-alpha (COS LIF), que se recolectan por lotes y se congelan a -80 °C.
   1. Cultive las células en placas que se han preincubado durante 1 - 3 h con gelatina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y luego se han lavado con PBS 1x. Alimente las células diariamente y divídalas cada 2 - 3 días, según su densidad.
      NOTA: Morfológicamente, las colonias de células madre embrionarias (ES) deben ser pequeñas, redondas y estar bien diferenciadas entre sí.
2. Pase las mESC a un formato de placa de 12 pocillos (100.000 células/pocillo) un día antes de la infección.
   1. Cuente las células con un hemocitómetro. Para células cultivadas en formato de 10 cm, aspire el medio antiguo, agregue 5 mL de PBS 1x, aspire el PBS y agregue 1 mL de tripsina al 0,25%. Incube las células en tripsina durante 8 min a 37 °C, agitando y golpeando suavemente la placa a la mitad del tiempo de incubación. El objetivo de este paso es obtener una suspensión de células individuales.
3. 48 h después del cambio de medio en las células de riñón embrionario humano 293T (HEK) de la placa de 15 cm, retire y transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL.
4. Centrifugue el sobrenadante a 300 x g durante 5 min para formar un pellet de restos celulares.
5. Filtre el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 µm.
   NOTA: Asegúrese de usar membranas de acetato de celulosa sin surfactante (SFCA), ya que algunos otros materiales pueden retener el virus y reducir considerablemente los rendimientos.
6. Concentre el virus mediante ultracentrifugación, utilizando una centrífuga con rotor SW32, y gire a 20.000 rpm (~72.000 x g) durante 2,5 h a 4 °C.
7. Mientras el virus se concentra mediante ultracentrifugación, trate las mESC CiA en la placa de 12 pocillos con medio ES fresco que contenga 5 µg/mL de polibreno.
8. Una vez finalizada la concentración del virus, aspire cuidadosamente el sobrenadante y suspenda el pellet viral en 100 µL de PBS 1x (evite burbujas excesivas).
9. Agregue el virus y PBS 1x a un tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Vortexe/agite el tubo a 300 x g (o en la configuración más baja) para suspender completamente el virus. Centrifugue brevemente el tubo en una mini-centrífuga de mesa durante 5 - 10 s para eliminar las burbujas.
10. Agregue 30 µL del virus a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Agite suavemente la placa y luego centrifúguela a 1.000 x g durante 20 min.
    NOTA: La cantidad de virus agregada puede variar según el título viral, que es inversamente proporcional al tamaño del constructo de entrega.
    1. Alternativamente, congele rápidamente el virus con nitrógeno líquido y almacénelo a -80 °C. Sin embargo, congelar el virus reducirá el título viral.
11. Devuelva la placa de 12 pocillos al incubador a 37 °C y cambie el medio a la mañana siguiente (~16 h después) por medio ES fresco.
12. Después de 48 h de infección, seleccione las células que integraron el plásmido viral agregando el antibiótico adecuado (por ejemplo, 1,5 µg/mL de puromicina, 10 µg/mL de blasticidina, etc.). Cambie el medio diariamente y lave las células con PBS 1x si la mayoría de las células están flotando o muertas. Mantenga el medio de selección sobre las células durante 72 - 96 h en un incubador a 37 °C con 5% de CO₂.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (para cultivo de tejidos)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Lotes individuales probados por calidad
Tubos para centrífuga de virus	Beckman Coulter	344058
Membrana de filtro para virus	Corning	431220
Poliabreno	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
Tripsina al 0,25 %	Gibco	25200-056	con EDTA
Tripsina al 0,05 %	Gibco	25400-054	con EDTA
Puromicina	InvivoGen	ant-pr
Ultracentrífuga	Optima	XPN-80
Rotor de centrífuga SW-32	Beckman Coulter	14U4354
Cubetas de centrífuga SW-32 Ti	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 células renales embrionarias humanas	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	Donación amable de G. Crabtree
Células Cos productoras de Lif-1C-alpha	Donación amable de J. Wysocka