Identificación de células infectadas con virus de la vaccinia recombinante mediante selección metabólica y fluorescente

Resumen

Fuente: Marzook, N. B., et al., Metodología para la Generación Eficiente de Proteínas del Virus Vaccinia Marcadas con Fluorescencia. J. Vis. Exp. (2014)

Este video demuestra la generación de virus vaccinia recombinantes mediante recombinación homóloga mediada por plásmido en células epiteliales infectadas. Marcadores fluorescentes y metabólicos permiten la selección e identificación de virus que expresan proteínas marcadas.

Protocolo

Generación de virus recombinantes

1. Según la Figura 1, infecte una monocapa de células BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (una línea celular epitelial de riñón de mono derivada de células CV-1)] con virus vaccinia en medio sin suero a una multiplicidad de infección (MOI) > 1.
2. 1 h después de la infección, recupere las células con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y transfecte con una mezcla de plásmido del vector de recombinación y reactivo de transfección en una proporción de 3:1 en medio sin suero.
3. Después de 24 h, raspe y recupere las células en DMEM sin suero bovino fetal (FBS) y realice tres ciclos de congelación-descongelación para romper las células y liberar partículas virales.
4. Realice un ensayo de placas con una cobertura líquida de DMEM con 10% de FBS y reactivos de selección GPT (fosforribosiltransferasa de guanina (de E. coli), ácido micofenólico (25 µg/ml) y xantina (250 µg/ml) de la siguiente manera:
   1. Siembre una placa de 6 pocillos con una monocapa de células BS-C-1.
   2. Infekte monocapas celulares al 100% de confluencia con diluciones seriadas de las células congeladas-descongeladas que contienen partículas virales para asegurar una separación adecuada de placas individuales.
   3. Cubra con DMEM líquido que contenga 10% de FBS y los reactivos de selección GPT: ácido micofenólico y xantina a concentraciones finales de 25 µg/ml y 250 µg/ml, respectivamente.
5. Tras una incubación de 24 h, retire la cobertura líquida y use un microscopio de fluorescencia para buscar placas que exhiban fluorescencia roja difusa correspondiente a la incorporación de mCherry desde el vector de selección transitoria dominante (TDS) en el virus. Dependiendo del gen diana y la etiqueta fluorescente elegida, también puede observarse fluorescencia localizada del gen marcado en la misma placa roja.
6. Seleccione múltiples placas para cada virus recombinante mediante raspado localizado con la punta de una pipeta y 100 µl de DMEM que contenga 5% de FBS para transferir las células a un tubo Eppendorf, seguido de tres ciclos de congelación-descongelación de las células raspadas para liberar virus recombinantes.
7. Añada el DMEM que contiene el virus congelado-descongelado a una monocapa de células en una placa de 12 pocillos para amplificar los virus recombinantes con reactivos de selección GPT en el medio de crecimiento. Raspe las amplificaciones exitosas 24 h después de la infección.
8. Realice un ensayo de placas de las placas amplificadas exitosamente que exhiban fluorescencia roja, esta vez con una cobertura de agarosa y selección GPT, de la siguiente manera:
   1. Siembre una placa de 6 pocillos con una monocapa de células BS-C-1.
   2. Realice una dilución seriada de los virus recombinantes e infecte los pocillos con diluciones crecientes de virus en DMEM sin FBS.
   3. 1 h después de la infección, retire el medio líquido y cubra cada pocillo con 0,5% de agarosa en medio esencial mínimo (MEM) que contenga 2,5% de FBS, 292 µg/ml de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, junto con los reactivos de selección GPT.
9. 2-3 días después de la infección, seleccione placas que muestren fluorescencia roja y también el color de la etiqueta fluorescente elegida para amplificarlas nuevamente, esta vez sin selección GPT.
10. Realice el siguiente ensayo de placas con una cobertura de agarosa sin selección.
11. Seleccione placas que hayan perdido su fluorescencia roja difusa pero que conserven la fluorescencia localizada correspondiente a la etiqueta elegida.
12. Continúe con la purificación por placas sin selección para obtener un stock puro de virus recombinantes que hayan perdido los genes de selección mCherry y gpt pero que conserven la fluorescencia localizada correspondiente a la etiqueta elegida. Verifique que los stocks sean puros mediante un ensayo de placas; todas las placas deben tener un fenotipo de placa similar.

Resultados

Figura 1. Esquema del procedimiento experimental para crear un virus vaccinia recombinante. Se muestran los eventos que ocurren a nivel genético y celular, junto con imágenes representativas de placas que describen los pasos tras la creación de un virus vaccinia fluorescente marcado con A3-GFP. (A) Las células infectadas con el virus vaccinia se transfectan con el vector de recombinación TDS. (B) En esta figura, solo se representa el resultado de la recombinación del extremo izquierdo, y el ejemplo utiliza GFP como etiqueta fluorescente elegida. La recombinación del extremo derecho daría como resultado la incorporación completa del plásmido TDS en el genoma de manera similar, excepto que la etiqueta se fusionaría con todo el gen diana en el paso intermedio, e.g., el paso C. Se realiza un ensayo de placa en una monocapa celular con la mezcla de recombinación y se somete a selección GPT. (C) Se seleccionan y amplifican placas que exhiben fluorescencia roja y verde, correspondientes a la expresión de mCherry y GFP, respectivamente. Una vez eliminada la selección, se produce la pérdida de la fluorescencia roja, lo que indica la pérdida de los genes gpt y mCherry (D), y se seleccionan y amplifican placas que muestran exclusivamente fluorescencia verde (E).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido micofenólico	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Disolver en NaOH 0,1 N
Xantina	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Disolver en NaOH 0,1 N
Reactivo de transfección FuGENE HD	Promega	E2311
Microscopio de fluorescencia equipado con filtros Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)