Transducción adenoviral combinada con el silenciamiento génico mediado por siRNA en células cancerosas

Resumen

Fuente: Fuchs, M. et al. Adenofección: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en la morfodinámica celular mediante experimentos de agotamiento y rescate. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la administración mediada por adenovirus de un transgén fluorescente combinada con la transfección de siRNA-fosfato de calcio en células de cáncer cervical. El adenovirus expresa una proteína de reemplazo fluorescente, mientras que el siRNA induce la degradación dirigida del ARNm mediante la unión al complejo RISC. Esta co-transfección secuencial permite el silenciamiento simultáneo de la proteína endógena y el rescate funcional mediante el transgén, lo que posibilita la visualización y confirmación del reemplazo proteico mediante imágenes de fluorescencia.

Protocolo

1. Transducción con adenovirus y silenciamiento de proteína endógena mediante transfección de ARN de interferencia pequeño (siRNA) en células HeLa-RFP-H2B utilizando precipitados de fosfato de calcio (CaPi)

NOTA: Se utiliza un adenovirus control que porta un gen no relacionado (es decir, LacZ) o ningún gen para alcanzar una multiplicidad de infección mínima (MOI) en todas las adenofecciones (10-20 unidades formadoras de placas (PFU)/célula), empleando la menor cantidad posible de adenovirus recombinante que porta el gen de interés.

NOTA: Se ha demostrado que este procedimiento ayuda a normalizar la expresión por célula en una población celular grande.

1. Un día después del siembra de células, cuente el número de células de la placa adicional sembrada. Aspire el medio y enjuague una vez con 1 mL de tripsina al 0,05 %/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Añada nuevamente 1 mL de tripsina al 0,05 %/EDTA e incube a 37 °C, 5 % CO₂ hasta que todas las células se hayan desprendido. Separe bien las células utilizando una pipeta de 1 mL y cuente el número de células por mL usando un hemocitómetro.
2. Determine la cantidad de virus necesaria para transducir las células a una MOI de 2 PFU de la proteína de interés (POI) por célula y 18 PFU por célula de un vector vacío (por ejemplo, LacZ), para obtener un total de 20 PFU por célula. Al mismo tiempo, transduzca 4 PFU de cada baculovirus que codifica actina marcada con proteína verde fluorescente (GFP) y α-tubulina marcada con proteína roja fluorescente (RFP). Transduzca las células utilizando el siguiente protocolo de adenofección.
3. Prepare en una campana estéril un tubo plástico de 1,5 mL para cada condición y añada 400 μL de medio mínimo esencial alfa (αMEM) tibio.
4. Descongele lentamente una alícuota de los virus sobre hielo y, si es necesario, diluya el stock de virus para pipetear un volumen mayor de 1 μL y minimizar errores de pipeteo.
5. Añada la cantidad calculada de virus por condición a cada tubo plástico de 1,5 mL que contiene 400 μL de αMEM y mezcle suavemente mediante pipeteo. Devuelva inmediatamente el stock de virus a -80 °C para mantener su actividad.
6. Aspire el medio de las células y pipetee suavemente la mezcla de virus gota a gota. Incube las células a 37 °C, 5 % CO₂ y agite las placas cuidadosamente bajo la campana estéril cada 15 min durante 1 h para asegurar que las células queden bien cubiertas con el virus. El uso de una pequeña cantidad de medio facilita el contacto del virus con las células.
7. Después de la incubación, pipetee suavemente 1,6 mL de αMEM a cada placa para obtener un volumen total de 2 mL, inicie la sincronización celular añadiendo timidina 2 mM e incube las células durante 2 h más a 37 °C, 5 % CO₂.
8. Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección con siRNA siguiendo el método de transfección con CaPi (véase Figura 1). Si no es necesaria la siRNA, reemplace la cantidad de siRNA por agua estéril para realizar una transfección vacía.
9. Calcule 200 μL de mezcla por cada condición, lo que resulta en 400 μL por duplicado. El siguiente ejemplo se proporciona para una concentración final de siRNA de 50 nM y debe adaptarse para cada proteína de interés. En un tubo plástico de 1,5 mL, pipetee 50 μL de CaCl₂ 1 M y 11 μL de siRNA 20 μM en 139 μL de H₂O estéril y mezcle mediante vortex. Tras una centrifugación rápida, añada cuidadosamente 200 μL de solución salina tamponada con HEPES (HBS2x) 2× (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01-7,05) gota a gota.
   NOTA: Cuanto más pequeñas sean las gotas, más pequeños serán los precipitados, lo que resulta en una mayor eficiencia de transfección. Mezcle suavemente tres veces mediante inyección de aire usando una pipeta de 200 μL.
10. Incube la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Añada lentamente 200 μL de la mezcla de transfección a cada placa y agite en cruz. Transfiera las placas a 37 °C, 5 % CO₂ durante 16 h.
11. Al día siguiente, enjuague las células dos veces con 2 mL de HEPES tibio (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) y añada 2 mL de αMEM. No trabaje con más de cuatro placas celulares a la vez, ya que las variaciones de temperatura afectan la duración del ciclo celular.
12. Visualice la eficiencia de infección bajo un microscopio fluorescente invertido con un aumento de 20-40x (en aire) y adquiera tres imágenes representativas por condición en los canales fluorescente y de transmisión para documentación. Siete horas después, añada timidina 2 mM e incube durante 16 h más a 37 °C, 5 % CO₂.
13. Al día siguiente, 48 h después de la transfección con siRNA y la infección viral, enjuague las células dos veces con 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) tibia y libérelas durante 7 h en 2 mL de αMEM sin Rojo de Fenol para imágenes en células vivas o con Rojo de Fenol para extracción de proteínas.
14. Recoga las células de cada condición a las 48 h posteriores a la transfección para la preparación de extractos proteicos y análisis por inmunotransferencia (Western blot) con el fin de determinar la eficiencia del silenciamiento y la expresión de la proteína endógena.
    NOTA: Utilice anticuerpos contra la proteína de interés, así como anticuerpos adecuados que sirvan como controles de carga. La eficiencia del silenciamiento debe determinarse cargando cantidades decrecientes de lisados de células control (transfectadas con siRNA control) para obtener una curva de titulación (es decir, 1, ½, ¼, ⅛).

Resultados

Figura 1. Planificación de un protocolo típico de adenofección. Se muestran los pasos sucesivos de un experimento típico para el protocolo que utiliza precipitados de CaPi (subrayados en gris) o el protocolo que emplea un reactivo de transfección con lípido catiónico (resaltado en amarillo), incluyendo la siembra celular, la transducción con adenovirus y baculovirus, la transfección con dúplex de siRNA y la sincronización celular mediante un bloque doble de timidina. En el lado derecho de la figura se muestran las líneas de tiempo en horas para ambos protocolos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
EDTA	Sigma	E5134
Suero bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectina	Sigma	F1141
Placas con fondo de vidrio, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Donación amable del Dr. Sabine Elowe, Québec, Canadá
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamina	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Medio Esencial Mínimo (MEM) Alfa	Wisent	310-101-CL
Medio Esencial Mínimo (MEM) Alfa sin desoxirribonucleósidos/ribonucleósidos	Thermo Fisher	12000-022
Medio Esencial Mínimo (MEM) Alfa sin rojo de fenol	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Diseño personalizado de adenovirus	Welgen	Custom design
Cloruro de calcio	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actina-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulina-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dúplexes de siRNA	Dharmacon	Custom design
Timidina	Sigma	T9250
Tripsina al 2,5%	Thermo Fisher	15090-046