Marcado de residuos de cisteína accesibles en la superficie de partículas similares a virus diseñadas

Resumen

Fuente: Natilla, A., y Hammond, R. W. Análisis de la accesibilidad al solvente de residuos de cisteína en partículas similares a virus del virus del rayado fino del maíz producidas en plantas de Nicotiana benthamiana y reticulación de péptidos a partículas similares a virus. J. Vis. Exp. (2013)

Este video demuestra la marcación fluorescente específica en un sitio de partículas tipo virus (VLPs) mutantes producidas en Nicotiana benthamiana utilizando un colorante reactivo con tiol, seguida de purificación y electroforesis en gel para confirmar la modificación superficial.

Protocolo

1. Inoculación del virus y purificación de partículas similares a virus (VLPs) a partir de plantas de Nicotiana benthamiana

1. Produzca transcritos de ARN-T7 con caperuza a partir de plásmidos vectoriales basados en el virus X de la papa (PVX) que porten los genes de la proteína de la cápside (CP) del virus del rayado fino del maíz (MRFV) tipo silvestre (wt) y mutado en cisteína, utilizando el kit T7-mMessage mMachine de Ambion.
2. Para cada reacción de transcripción de ARN-T7, inocule dos hojas completamente expandidas de N. benthamiana con 10 μL de reacción e incube las plantas durante 10 días en invernadero, con 60 % de humedad, 16 h con luz (25.000-30.000 lux) a 25 °C y 8 h de oscuridad a 20 °C.
3. Recolecte las hojas infectadas por el virus de N. benthamiana a los 10 días posteriores a la inoculación (dpi), pese el tejido vegetal (50 gramos) y colóquelo sobre hielo.
4. Homogenice el material vegetal en una licuadora en presencia de 100 mL de una solución fría de tampón de citrato de sodio 0,5 M, pH 5,5 (utilice 2 mL de tampón por gramo de tejido vegetal).
5. Filtre el homogenato a través de 3 capas de gasa y clarifique mediante centrifugación a 27.000 × g durante 30 min. Transfiera el sobrenadante a un cilindro graduado frío, mida el volumen y luego transfiéralo a un vaso de precipitados estéril y frío. Deseche el precipitado.
6. Procese el sobrenadante añadiendo polietilenglicol 8.000 (PEG 8.000) al 10 %, agite durante 15 min a 4 °C e incube adicionalmente durante 45 min a 4 °C para precipitar la matriz de partículas tipo virus (VLPs)-PEG.
7. Centrifugue la muestra a 27.000 × g durante 20 min a 4 °C y elimine el sobrenadante.
8. Procese el precipitado añadiendo 8 mL de tampón de citrato de sodio 0,05 M, pH 5,5, que contenga 2 % de Triton X-100. Agite bien los tubos de centrífuga para liberar el precipitado. Transfiera el precipitado y el tampón a un vaso de precipitados estéril y frío. Enjuague inmediatamente los tubos con 2 mL del mismo tampón y añádalos al vaso. Agite la suspensión a 4 °C hasta que los precipitados se disuelvan (generalmente 1 h).
9. Clarifique mediante centrifugación durante 5 min a 27.000 × g, deseche el precipitado y procese el sobrenadante mediante centrifugación a 140.000 × g durante 2 h a 4 °C.
10. Reuspenda el precipitado en 1 mL de tampón de citrato de sodio 0,05 M, pH 5,5, y coloque la suspensión sobre un gradiente de sacarosa del 10-40 % preparado en tampón de citrato de sodio 0,05 M, pH 5,5.
11. Centrifugue el gradiente durante 3 h a 140.000 × g a 4 °C.
12. Ilumine la parte superior del tubo de centrífuga y recolecte la banda superior dispersora de luz a 4 cm desde la parte superior del tubo, diluya con tampón de citrato de sodio 0,05 M, pH 5,5, y centrifugue durante 3 h a 140.000 × g a 4 °C.
13. Reuspenda el precipitado en 0,5 mL de agua estéril y almacénelo a 4 °C durante hasta seis meses.
14. Cuantifique la concentración de VLPs realizando un ensayo de proteína de Bradford. El rendimiento de VLPs está entre 1 y 3 μg/g de tejido vegetal.

2. Reacciones de etiquetado con fluoresceína-5-maleimida de partículas similares a virus (VLPs)

1. Prepare una solución de 1 mM de fluoresceína-5-maleimida (427,37 g/mol) en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0; 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Mezcle mediante un vórtex y verifique la disolución completa. Proteja el tubo de la luz utilizando papel de aluminio.
2. Añada fluoresceína-5-maleimida a las partículas tipo virus (VLPs) producidas en el paso 1 y mezcle. Utilice un exceso molar 25 veces mayor de fluoresceína-5-maleimida respecto a la cantidad molar de sulfhidrilos. En general, usar 30 μL de VLPs a una concentración de 1 μg/μL y 60 μL de la solución de fluoresceína-5-maleimida produce resultados aceptables.
3. Incube la reacción durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
4. Detenga la reacción añadiendo ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 50 mM.
5. Elimine la fluoresceína no reaccionada utilizando una columna giratoria de desalado (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) y centrifugando durante 2 min a 1.500 × g a temperatura ambiente.
6. Para el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), añada 10 μL de tampón muestral Laemmli 2 × SDS-PAGE a 10 μL de cada reacción. Almacene la proteína marcada protegida de la luz a 4 °C durante un mes como máximo o en alícuotas de un solo uso a -20 °C durante hasta 3 meses.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos ultralimpios de pared delgada	Beckman	344059
Kit mMESSAGE mMACHINE T7	Life Tecnologies	AM1344M
Fluoresceína-5-maleimida	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 está fuera de stock; sustituir por F150
Buffer de Laemmli	Bio-Rad	1610737
Buffer de corrida Tris-Glicina SDS (dodecilsulfato de sodio)	Invitrogen	LC2675
Buffer de transferencia Tris-Glicina	Invitrogen	LC3675
Sándwich de papel filtro y membrana de nitrocelulosa	Invitrogen	LC2001
PEG (polietilenglicol) maleimida enlazable EZ-Link 2-biotina, formato sin pesaje	Thermo Scientific	21901