Producción de partículas similares a virus en E. coli modificada genéticamente

Resumen

Fuente: Chen, Z., et al. Elaboración de partículas tipo virus PEGiladas fluorescentes inducidas por conjugación mediante química de dibromomaleimida-disulfuro. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el método para la expresión controlada de la proteína de la cápside del bacteriófago Qβ en E. coli modificada genéticamente. Las proteínas resultantes se autoensamblan en partículas similares a virus, que se recolectan para bioconjugación posterior.

Protocolo

Expresión de Qβ

1. Limpie el área de trabajo con una mezcla 1:1 de lejía/etanol.
2. Prepare dos cultivos iniciadores de 3 mL en un ambiente aséptico añadiendo colonias individuales de E. coli BL21(DE3) a 3 mL de medio caldo óptimo superior (SOB) en un ambiente aséptico.
3. Incube en agitador a 250 rpm en una habitación a 37 °C y 0 % de humedad relativa (rH) durante la noche.
4. Inocule el cultivo iniciador en medio SOB:
   1. Retire ambos cultivos iniciadores de 3 mL del agitador y, en un ambiente aséptico, vierta cada cultivo en uno de dos matraces Erlenmeyer baffled de 2 L que contengan 1 L de medio SOB fresco cada uno.
   2. Coloque el medio inoculado en un agitador a 250 rpm en una habitación a 37 °C y 0 % de rH.
5. Cultive las bacterias en agitador a 250 rpm en una habitación a 37 °C y 0 % de rH hasta que la DO₆₀₀ alcance entre 0,9 y 1,0.
6. Añada 1 mL de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) 1 M utilizando una pipeta P1000 para inducir la expresión proteica.
7. Deje el medio en agitación a 250 rpm en una habitación a 37 °C y 0 % de rH durante la noche.
8. Al día siguiente por la mañana, retire el medio del agitador y céntrelo usando botellas de 1000 mL a 20.621 × g durante 1 h a 4 °C para recolectar las células.
9. Descarte el sobrenadante y recoja el botón celular.
   1. Vierta el sobrenadante en un matraz con aproximadamente 5 mL de lejía para matar las bacterias. Este material es desecho.
   2. Utilice una espátula para raspar el botón celular desde el fondo de la botella de centrífuga y coloque el botón en un tubo cónico de 50 mL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo LB (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Triptona, polvo	Research Products International	T60060-1000.0
Extracto de levadura, polvo	Research Products International	Y20020-1000.0
Sulfato de magnesio anhidro	P212121	CI-06808-1KG
Cloruro de sodio (cristalino/Certificado ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	BP366-500
Sistema de purificación de agua Elga PURELAB Flex 3	Fisher Scientific	4474524
Fosfato monobásico de potasio	Fisher Scientific	BP362-1
Fosfato dibásico de potasio anhidro	Fisher Scientific	P288-500
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Botellas centrífugas Nalgene con tapas, copolímero de polipropileno	Thermo Scientific	3141-0250
Agitador orbital VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetaman P1000	Gilson	F123602
Tubo cónico centrífugo Falcon de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22