Funcionalización fluorescente de partículas similares a virus mediante el puenteo de disulfuros

Resumen

Fuente: Chen, Z., et al. Elaboración de partículas tipo virus PEGiladas fluorescentes inducidas por conjugación mediante química de dibromomaleimida-disulfuro. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la funcionalización fluorescente de partículas similares a virus mediante la reconstitución de disulfuros reducidos con un enlazador de polietilenglicol (PEG), produciendo conjugados estables y rastreables adecuados para imágenes celulares y entrega dirigida en aplicaciones biomédicas.

Protocolo

1. Conjugación de compuestos de dibromomaleimida (DB) en el bacteriófago Qβ

1. Reducir los disulfuros en Qβ.
   1. Disuelva 0,0020 g de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en 1 mL de agua ultrapura para preparar una solución stock 100x.
      NOTA: Prepare TCEP fresco antes de la reducción.
   2. Añada 200 µL de Qβ (5 mg/mL) a un tubo de microcentrifugado.
   3. A continuación, añada 20 µL de la solución stock 100x de TCEP.
   4. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
2. Reconectar los disulfuros reducidos utilizando polietilenglicol dibromomaleimida (DB-PEG).
   1. Disuelva 0,0017 g de polietilenglicol-dibromomaleimida (DB-PEG) en 100 µL de DMF.
   2. Añada 680 µL de solución de fosfato sódico 10 mM (pH 5).
   3. Añada Qβ reducido a la solución de DB-PEG y observe el proceso de mezcla bajo una lámpara UV (ultravioleta) de 365 nm. La fluorescencia amarilla brillante puede visualizarse inmediatamente con una lámpara UV portátil de 365 nm al mezclar.
   4. Deje que la reacción continúe durante la noche a temperatura ambiente (RT) en un rotisero.
3. Purifique la mezcla de reacción mediante filtro centrífugo (corte de peso molecular (MWCO) = 10 kDa) tres veces usando PBS 1x (solución salina tamponada con fosfato) a 3.283 x g durante 20 min a 4 °C.
4. Controle la conjugación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS sin agentes reductores (SDS-PAGE) y electroforesis en gel de agarosa nativa.
   NOTA: Las partículas tipo virus (VLPs) migran como partículas intactas en gel de agarosa nativo y se separan según su carga, tamaño y forma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,3-Dibromomaleimida 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polietilenglicol	Alfa Aesar	41561-22
Fosfato de sodio	Fisher Scientific	AC424375000
Acrilamida/bis-acrilamida	P212121	RP-A11310-500.0
Dodecilsulfato de sodio	Sigma Aldrich	L3771-100G
Persulfato de amonio	Fisher Scientific	BP179-100
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
Tubo cónico centrífugo Falcon de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
Tubo microcentrífugo: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Agitador orbital VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P10	Gilson	F144802
Balanza de laboratorio clásica de alta precisión Intel Weighing PM-100	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100