Preparación segura de muestras virales para microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Fuente: Blancett, C. D., et al. Utilización de cápsulas para tinción negativa de muestras virales dentro de contención biológica. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra la preparación segura de muestras virales para microscopía electrónica de transmisión. Las partículas virales se fijan con glutaraldehído, se tiñen con un agente denso a los electrones y se someten a fijación por vapor con tetraóxido de osmio para estabilizar las estructuras y garantizar la inactivación completa, asegurando así el manejo seguro de las muestras virales mientras se mejora el contraste para obtener imágenes de alta calidad en microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Protocolo

1. El método de la cápsula para tinción negativa en biocontención utilizando glutaraldehído acuoso e inactivación con vapor de tetroxido de osmio al 1 %

1. Dentro del gabinete de seguridad biológica (BSC) de contención biológica, aspire 40 µL de suspensión viral hacia la cápsula unida a una pipeta.
   NOTA: La pipeta permanece unida a la cápsula hasta que el proceso haya finalizado.
2. Coloque la pipeta de lado durante 10 min con las rejillas orientadas horizontalmente. Esto promueve una distribución uniforme de las partículas virales sobre las rejillas recubiertas.
3. Inactive el virus dentro de la cápsula dentro del BSC de contención biológica.
   1. Levante la pipeta y presione el émbolo para dispensar la solución viral en un recipiente de desecho.
   2. Aspire 40 µL de fijador de glutaraldehído al 2% hacia las cápsulas.Precaución: El glutaraldehído es un producto químico peligroso y requiere protección adecuada. El glutaraldehído puede usarse durante períodos breves en un BSC normal, pero para manipulaciones prolongadas con el reactivo expuesto se debe trabajar en un BSC conectado a conductos o en una campana extractora de gases.
   3. Coloque la pipeta de lado durante 20 min. Esto asegura que las muestras queden bien fijadas.
   4. Expele el fijador y aspire 40 µL de agua DI (desionizada) hacia las cápsulas para lavar el fijador. Repita este paso de lavado un total de 3 ciclos de enjuague.
4. Aspire 40 µL de acetato de uranilo al 1% (UA) o ácido fosfotungstico de potasio al 1% (PTA) hacia las cápsulas y deje reposar durante 30 s.
   NOTA: El tiempo de tinción puede variar entre 10 s y 1 min dependiendo de la muestra viral.
   PRECAUCIÓN:: El UA es un emisor alfa y una toxina acumulativa. Manipúlelo con la protección adecuada.
5. Retire la cápsula de la pipeta y seque las rejillas tocando con un trozo de papel filtro al borde de las rejillas mientras las rejillas permanecen dentro de la cápsula.
6. Procedimiento de inactivación con vapor de óxido de osmio.
   1. Coloque la cápsula, con la tapa abierta, dentro de un tubo cónico de 50 mL que contenga papel filtro empapado en una solución de óxido de osmio al 1%.Precaución: El óxido de osmio es extremadamente tóxico y tiene baja presión de vapor. Debe usarse en un BSC conectado a conductos o en una campana extractora de gases. Manipúlelo con la protección adecuada. Coloque información de advertencia en el área de trabajo.
   2. Selle el tubo cónico de 50 mL durante 1 h para permitir la permeación completa del vapor de óxido de osmio. Luego, descontamine y transfiera el tubo fuera de la zona de contención biológica hacia la instalación de microscopía electrónica (EM) de nivel BSL-2.
7. Retire las rejillas EM de la cápsula.
   1. En la instalación de microscopía electrónica (EM) de nivel BSL-2, retire la cápsula del tubo cónico y colóquela sobre una pipeta.
   2. Aspire 40 µL de agua DI hacia la cápsula y dispense el agua en un recipiente de desecho tres veces.
   3. Retire la cápsula de la pipeta y seque las rejillas usando papel filtro para tocar el borde de las rejillas.
   4. Tras el secado al aire, almacene las rejillas para su posterior obtención de imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Parrillas TEM recubiertas con Formvar/carbono	SPI	3420C-MB	200 mallas Cu Pk/100
Cápsulas mPrep/g	EMS	85010-01	caja
Acopladores mPrep/f	EMS	85010-11	estándar 16/Pk
Glutaraldehído	EMS	16320	solución al 50%, grado EM
Tetraóxido de osmio	EMS	19190	solución acuosa al 4%
Acetato de uranilo	EMS	22400	polvo
Ácido fosfotungstico de potasio	EMS	19500	polvo
Papel de filtro	Whatman	1450-090	tamaño 50
Microscopio electrónico de transmisión	JEOL	JEM-1011	TEM