El video demuestra la detección de intermediarios de ARNdc del virus Zika en células epiteliales infectadas mediante inmunocitoquímica. Las células infectadas se fijan y luego se bloquean con una solución de bloqueo. Se añaden los anticuerpos primario y secundario. Los núcleos se tiñen con un colorante fluorescente. El ARNdc viral marcado se observa entonces mediante microscopía de fluorescencia.
Artículo de método
Detección de intermediarios de replicación de dsRNA del virus del Zika mediante inmunocitoquímica
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30 de septiembre de 2026
En este artículo
Resumen
Protocolo
1. Ensayo de replicación del genoma viral del Zika
- Siembre células Vero naïve a 1 x 105 células por pocillo en volúmenes de 2 ml utilizando una placa de 12 pocillos. Al día siguiente, prepare inóculos virales (Multiplicidad de Infección (MOI) de 0,01 y 0,1; 400 µl/pocillo) de título bajo y alto utilizando medio sin suero, en triplicado. Para la infección simulada, utilice solo medio sin suero (400 µl/pocillo).
- Incube la placa inoculada a 37 °C con 5% de CO2 durante 4-6 horas. Distribuya el inóculo inclinando suavemente la placa lateralmente cada hora.
- Al final de la incubación, reemplace el inóculo con medio suplementado con suero (2 ml por pocillo).
- En los puntos temporales de 48 y 96 horas, recoja las muestras para inmunocitoquímica (ICC).
- Realice la ICC utilizando células fijadas con metanol.
- Lave las células fijadas tres veces con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y bloquee con tampón bloqueante para ICC (3% de suero de cabra, 3% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,1% de Triton-X 100 en PBS).
- Utilice el anticuerpo monoclonal de ratón anti-RNA bicatenario J2 (1 µg/ml) en una dilución de 1:100 en tampón bloqueante e incube durante la noche a 4 °C.
- Lave las células con PBS 1x y añada un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón IgG-594 (1 µg/ml) en una dilución de 1:1.000 en el tampón bloqueante e incube durante una hora a temperatura ambiente.
- Lave las células con PBS 1x y tiña los núcleos utilizando el colorante Hoechst y observe las células mediante un microscopio de fluorescencia con un aumento de 100X (Figura 1).
Resultados
Figura 1: Ensayos para evaluar la replicación del virus del Zika (ZIKV). (A) El gráfico muestra el contenido genómico del virus del Zika medido mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Tanto los cebadores pan-genotipo (ZIKV GEN) como los del linaje PRVABC59 (ZIKV UNI) mostraron igual sensibilidad y especificidad. Como era de esperar, los cebadores del virus de la hepatitis C (HCV) no amplificaron ningún producto. (B) El gráfico presenta la cinética de crecimiento del virus del Zika en los puntos de tiempo indicados, en células infectadas con título bajo y alto, en comparación con el control mock no infectado. Se indican los valores medios y las desviaciones estándar. (C) Ensayo de inmunocitoquímica para investigar la replicación viral. Las células infectadas con el virus del Zika fueron marcadas específicamente con anticuerpos contra dsRNA. A las 48 hpi, las células infectadas se encuentran en algunos cúmulos, mientras que a las 96 hpi, la mayoría de las células están infectadas. Se utilizó tinción con Hoechst para la visualización de los núcleos (Barra de escala = 50 µm). BF: imagen de campo brillante.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Anticuerpo monoclonal de ratón anti-RNA bicatenario J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| Línea celular Vero | ATCC | CCL-81 | |
| Cepa viral del Zika PRVABC59 | Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) | ||
| Microscopio de inmunofluorescencia Nikon Eclipse Ti con C-HGFI Nikon Intensilight | Nikon | Visit Nikon for Request |
