Concentración y purificación de partículas virales

Resumen

Fuente: Fricano-Kugler, C. J., et al. Diseño, empaquetado y administración de retrovirus y lentivirus CRISPR de alto título mediante inyección estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra el proceso paso a paso para concentrar y purificar partículas lentivirales a partir de una suspensión mixta que contiene restos de células huésped. El procedimiento utiliza centrifugación, filtración y precipitación con PEG-sal para aislar las partículas virales eliminando al mismo tiempo impurezas solubles. El producto final se resuspende en un tampón y se almacena a temperaturas ultra bajas para preservar la infectividad viral y la integridad estructural.

Protocolo

1. Concentración y Purificación del Virus

1. Prepare una solución 5x de polietilenglicol 6000 añadiendo 40 % de polietilenglicol 6000 y 1,5 M de NaCl a H₂O dd. Autoclave la solución en el ciclo para líquidos durante 45 min a 121 °C. Mezcle lentamente la solución durante el enfriamiento.
   NOTA: La solución comenzará turbia y luego se volverá transparente al enfriarse.
2. Centrifugue el tubo cónico de 50 ml que contiene ambas recolecciones del sobrenadante viral a 2.000 x g durante 10 min para formar el precipitado del material insoluble. Purifique el medio viral filtrándolo a través de un filtro de jeringa de baja unión a proteínas de 0,45 µm (PES o PVDF).
3. Añada la solución 5x de polietilenglicol 6000 al medio (la concentración final debe ser 8 % de polietilenglicol 6000 y 0,3 M de NaCl). Mezcle invirtiendo el tubo varias veces (no use vórtex). Incube la solución de polietilenglicol que contiene el virus a 4 °C durante 12 h o más, remezclando ocasionalmente.
4. (Día 9) Centrifugue la solución de polietilenglicol que contiene el virus a 2.500 x g durante 45 min. Retire y deseche el sobrenadante y centrifugue nuevamente durante 2 min. Vuelva a retirar y desechar el sobrenadante.
5. Reuspenda el precipitado añadiendo 320 µl de solución salina tamponada con fosfatos estéril (los 320 µl equivalen a 1/100 del volumen original del medio que contiene el virus recolectado) e incube durante la noche a 4 °C. Opcionalmente, resuspenda el precipitado a temperatura ambiente en un agitador durante 30 min.
6. Después de resuspender el precipitado, alícuote el virus (5-10 µl por tubo de 0,5 ml) y congele los alícuotas a -80 °C (los ciclos de congelación-descongelación o el almacenamiento a 4 °C reducirán drásticamente el título).
7. Determine el título de los virus utilizando protocolos estándar, es decir, realice una serie de diluciones en una placa de 6 pocillos con células HEK293T y cuente manualmente las colonias fluorescentes 48 h después.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lista de reactivos para transfección
Tubos de poliestireno de 5 ml	Fisher Scientific	352054
polietilenglicol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	National Diagnostics	CL-253
Tubos microcentrífugos de 0,5 ml	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A