Evaluación de un sistema de recubrimiento líquido para ensayos de placa viral

Resumen

Fuente: Baer, A. y Kehn-Hall, K. Determinación de la Concentración Viral mediante Ensayos de Placa: Uso de Sistemas de Cobertura Tradicionales y Nuevos. J. Vis. Exp. (2014).

Este video demuestra el uso de una capa superior líquida a base de celulosa microcristalina en un ensayo basado en placas, comparando su eficacia en la formación de placas virales con la de una capa superior semisólida tradicional de agarosa.

Protocolo

1. Preparación de células y reactivos

1. El día anterior al ensayo, siembre las células huésped apropiadas para el virus en cuestión (Tabla 1 y Tabla 2) al 90 - 100 % de confluencia.
2. Preparar una solución fijadora de formaldehído al 10% en H₂Por ejemplo, mezcle 5,56 ml de formaldehído al 36% en stock con 14,44 ml de H₂O destilada.₂O (dH₂O)₂O).
   NOTA: Utilice prácticas adecuadas de manipulación segura y ventilación al emplear formaldehído.
3. Preparar la tinción con violeta de cristal: violeta de cristal (VC) al 1% en etanol al 20% y agua dH₂O.
4. Preparar medio de placas 2x (dependiente del tipo celular, a concentración 2x; véase Tabla 2). Filtrar utilizando un 0.2 µm filtre si algún reactivo no es estéril.
5. Preparación de recubrimientos inmovilizantesTabla 3)
   1. Para los recubrimientos líquidos, prepare una solución estéril al 2,4% de Avicel en agua dH₂O. Para evitar la formación de grumos, agregue el polvo a un matraz que contenga agua y que se esté mezclando rápidamente con una barra magnética; vierta el Avicel lentamente y agite rápidamente a temperatura ambiente (TA). Cuando la solución sea demasiado viscosa para que la barra magnética la homogenice, cambie a un agitador orbital para matraz. >30 min con agitación intensa para asegurar una homogeneización uniforme.
      NOTA: Las soluciones stock pueden prepararse a concentraciones más bajas, pero es posible que se separen y será necesario volver a mezclarlas para asegurar la homogeneización. Se pueden utilizar soluciones de trabajo de Avicel en un rango de 0,6-3%.
   2. Después de la homogenización, autoclavar la solución y almacenarla sellada a temperatura ambiente.
   3. Para los recubrimientos de agarosa y de carboximetilcelulosa (CMC), prepare una solución stock en dH₂O de CMC al 2 % o agarosa al 0,6 %. Mezclar con una barra de agitación y autoclavar o calentar en microondas hasta disolución completa.

2. Diluciones e infecciones

1. Al día siguiente de la siembra, verifique visualmente la confluencia y viabilidad de las células antes de iniciar el ensayo. Asegúrese de que la morfología celular sea estándar y de que esté presente una monocapa con una confluencia de aproximadamente el 90 %.
2. Realice una dilución seriada decimal de las muestras infecciosas. Utilice el medio de crecimiento celular para la propagación viral como diluyente (Tabla 2). Varíe el número de diluciones necesarias según el título esperado del virus en cuestión, y siempre use una muestra control no infectada para garantizar de forma independiente la viabilidad celular y ayudar en la identificación de las placas.
3. A partir de las diluciones seriadas, infecte las células durante 45 minutos a 1 hora (Tabla 1). Use un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto del virus con la monocapa (Tabla 4). Agite suavemente las placas cada 20 minutos para asegurar una cobertura uniforme y evitar que la monocapa celular se seque.
4. Después de la infección, agregue directamente en el pocillo un volumen adecuado de medio inmovilizante sobre los inóculos (Tabla 2), utilizando una mezcla 1:1 de medio de placas 2x y el recubrimiento inmovilizante elegido (CMC, agarosa o Avicel). Agite suavemente para mezclar.
   1. Para recubrimientos líquidos, mezcle 1:1 medio de placas 2x calentado con solución stock de Avicel al 1,2 - 2,4 % a temperatura ambiente para obtener una solución de trabajo con un medio de recubrimiento de Avicel al 0,6 - 1,2 %.
   2. Para un recubrimiento de agarosa, use una mezcla 1:1 de medio de placas 2x calentado y una solución stock de agarosa al 0,6 % calentada, coloque en un baño de agua a 56 °C durante 30 minutos para equilibrar la temperatura, obteniendo una concentración final de recubrimiento/agarosa del 0,3 %.
   3. Para CMC, prepare una solución stock al 2 % y trátela como se describe para el recubrimiento de agarosa.
   4. Al aplicar el recubrimiento sobre la monocapa, equilibre siempre la agarosa caliente o el CMC en agua a 56 °C para evitar dañar la monocapa. Asegúrese de que la solución esté tibia, pero no caliente al tacto, para prevenir la muerte celular y la reducción de los títulos virales. La mayoría de los recubrimientos de agarosa comienzan a solidificarse por debajo de 42 °C; trabaje rápidamente y/o prepare lotes pequeños para evitar la solidificación durante el manejo.
5. Después de añadir el recubrimiento, incube las placas para producir placas bien definidas y claramente contables. La formación de placas puede tardar entre 2 y 14 días, dependiendo del virus que se analice (Tabla 1).
   NOTA: Una vez que las placas con recubrimiento líquido se colocan en la incubadora, no las mueva. El movimiento de los recubrimientos líquidos durante el período de incubación dará lugar a placas difusas. Los recubrimientos de agarosa y CMC son semisólidos y pueden moverse o examinarse periódicamente bajo un microscopio de luz para monitorear el desarrollo de las placas.

3. Fijación y tinción de células

1. Para fijar las células, deseche o aspire la cobertura de Avicel y fije las células utilizando la solución de formaldehído al 10 % durante 30 minutos hasta toda la noche (<1 ml por pocillo para una placa de 6 pocillos).
   1. Para agarosa o CMC, agregue directamente la solución de formaldehído a la cobertura durante 1 hora hasta toda la noche.
      NOTA: Las muestras pueden conservarse durante períodos prolongados en el fijador, siempre que este no se evapore ni se seque, ya que esto podría distorsionar la monocapa.
2. Antes de la tinción y tras la fijación, deseche el formaldehído y elimine los tapones semisólidos de agarosa y CMC con agua corriente o manualmente con una espátula. Enjuague las placas de Avicel con agua para eliminar el residuo de la cobertura o del fijador antes de la tinción.
3. Para la tinción, cubra las células con una cantidad mínima de solución de violeta de cristal durante aproximadamente 15 minutos. Agite suavemente las placas si es necesario para asegurar una cobertura uniforme.
4. Lave suavemente el colorante violeta de cristal con agua. Una vez fijadas, teñidas y secas, almacene las placas indefinidamente para su análisis futuro.

Tabla 1. Condiciones de Inoculación y Tipos de Células para el Ensayo de Placas

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de célula	Vero	Vero	MDCK
Período de infección	1 hr	1 hr	45 min
Tiempo de incubación	3 días	2 días	3 días

 

Tabla 2. Medios de crecimiento celular y viral y de placas

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de célula	Vero	Vero	MDCK
Tipo de crecimiento	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Medio para placas	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina.

Medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,2% de albúmina sérica bovina, 0,025% de HEPES, DEAE-dextrano 50ug/ml.

A. Medio Mínimo Esencial 2x (500 ml) suplementado con 5 % de SFB (25 ml), 1 % de Aminoácidos Mínimos Esenciales (5 ml), 1 % de Piruvato de Sodio (5 ml), 1 % de L-Glutamina (5 ml), 2 % de Pen/Estrepto (10 ml).

B. Medios Mínimos Esenciales 2x (500 ml) suplementados con 0,2 % de Albúmina Sérica Bovina, 1 % de Aminoácidos Mínimos Esenciales (5 ml), 50 µg/ml, 0,025 % de HEPES, DEAE-Dextrano, Tripsina-TPCK*

*Inmediatamente antes de la preparación, agregue 1 µl por cada 25 ml de un stock de 2 µg/ml de tripsina TPCK al alícuota que utilizará para mezclar con agarosa para las placas.

Tabla 3. Soluciones base de recubrimientos

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de célula	Vero	Vero	MDCK
Período de infección	1 hr	1 hr	45 min
Tiempo de incubación	3 días	2 días	3 días

 

Tabla 4. Formatos de placas

	6 pocillos	12 pocillos	96 pocillos
Número de células/pocillo	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Volumen de inóculo (μl)	400	200	50
volumen de cobertura (ml)	3	1.5	0.100

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
violeta de cristal	Sigma Aldrich	C3886-25G
Solución de formaldehído	Sigma Aldrich	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Agite vigorosamente al reconstituir para >30 min para homogeneizar
UltraPure agarosa	Invitrogen	16500-100
Carboximetilcelulosa, sal sódica de viscosidad media	Sigma Aldrich	C4888