ARN de interferencia se ha demostrado muy eficaz para analizar la función del gen en Drosophila El desarrollo traqueal. Un protocolo detallado utilizado por Jiang laboratorio para inyectar dsRNA en embriones de la mosca de la expresión génica caída se ilustra. Esta técnica tiene el potencial de genes de detección necesarios para el desarrollo de órganos y tejidos en Drosophila.
Artículo de método
RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones
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Resumen
Resumen
Una prueba genética es uno de los métodos más eficaces para obtener conocimientos en un proceso biológico complejo. Con los años muchas mejoras y herramientas para la manipulación genética se han convertido en disponibles en Drosophila 2. Poco después del descubrimiento inicial de Frie y Mello 3 ARN de doble cadena que puede ser utilizado para derribar la actividad de genes individuales en Caenorhabditis elegans, el ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado proporcionar una poderosa aproximación genética inversa para analizar las funciones de genes en el desarrollo de Drosophila órgano 4, 5.
Muchos órganos, incluidos los de pulmón, riñón, hígado y sistema vascular, se componen de redes ramificadas tubular que transportan líquidos o gases vitales 6, 7. El análisis de la formación de Drosophila traqueal proporciona un excelente sistema modelo para estudiar la morfogénesis de otros órganos tubulares 8. El Berkeley Drosophila Genome Project ha revelado cientos de genes que se expresan en el sistema traqueal. Para estudiar el mecanismo molecular y celular de la formación del tubo, el reto es entender el papel de estos genes en el desarrollo de la tráquea. En este sentido, se describe un método detallado de dsRNA inyección en embriones de Drosophila para la expresión de genes individuales caída. Con éxito derribado dysfusion endógena (días) la expresión génica por inyección de dsRNA. Disfunción es una proteína bHLH-PAS expresa en las células de fusión traqueal, y se requiere para la rama traqueal fusión 9, 10. disfunción RNAi elimina completamente la expresión disfunción y dio lugar a defectos de fusión traqueal. Este método relativamente simple proporciona una herramienta para identificar los genes requried para tissure y desarrollo de los órganos de la Drosophila.
Protocolo
1. De recogida de embriones
- Establecer las jaulas a 25 ° C con 2-4 días de edad, w 1118 placas de jugo de flies.Grape se cambian cada hora durante el día para sincronizar la recolección de huevos en periodo de 1-2 días antes de la recolección
- Recoger los embriones durante 1 hora a 25 ° C
- Corte un pedazo rectangular de agar jugo de uva, de corte ligeramente en la mitad con una cuchilla de afeitar, dejar una línea en el agar
- Utilizar una sonda de metal para la transferencia de embriones a partir de la placa de jugo de uva con su trozo de agar jugo de uva, que se alinean en una línea recta con el eje más largo del embrión en un ángulo de 45 grados a la línea en el centro del agar. Obtener una línea recta de unos 50 embriones. Asegúrese de que todos los punto de embriones en la misma dirección, con el extremo posterior en dirección opuesta a la línea.
- Corte un pedazo rectangular de cinta adhesiva doble, y el lugar a un cubreobjetos 18x18mm.
- Recoger los embriones con cinta adhesiva doble en la hoja de la cubierta
- Coloque la hoja de la cubierta de una lámina de vidrio y seco del embrión en el aire durante unos 10 min.
- Cubrir el embrión de una fina capa de aceite de halocarbonos 700, ahora está listo para la inyección.
2. Tirar la aguja
Hacen que las agujas de microinyección tirando tubos capilares. Nosotros usamos un extractor de aguja de precisión de instrumentos del mundo (modelo PUL-1). Las especificaciones extractor aguja programa son: calor: clase 1, el retraso 4.
3. Llenado de las agujas
La carga de back-agujas con la pipeta Eppendorf P20 equipada con puntas Eppendorf Microloader, normalmente la carga 1.5-2 dsRNA l
4. Quiebre de las agujas
- Antes de romper la aguja, coloque un cubreobjetos sobre un portaobjetos.
- Prepara un portaobjetos con una gota de aceite en el centro de la diapositiva
- Encienda el picopump Picospritzer III para ajustar la presión del aire
- Romper la aguja llena hasta el borde de una hoja de cubierta, creando una punta afilada.
- Cuando la punta se rompe, el paso en el pedal de Picospritzer III picopump, algunos dsRNA se saldrá de la punta de la aguja.
- Sacar el portaobjetos con cubreobjetos.
- Inserte la aguja debajo de la gota de aceite en el centro de la diapositiva preparada antes.
- Ajustar las configuraciones en el picopump Picospritzer III para obtener el 100-200PL dsRNA cuando usted pisa el pedal. dsRNA puede ser visto como una pequeña gota.
5. Inyección
- Llevar la punta de la aguja a la parte posterior del embrión blastodermo primera vez en el mismo plano focal y se inyecta el embrión fuera del centro alrededor del 30-50% la longitud de huevo.
- Después de pisar el pedal del picopump Picospritzer III, una pequeña cantidad de dsRNA aparecerá como un punto pequeño en el sitio de la inyección.
6. El análisis fenotípico
- Después de la inyección, colocar la placa en una cámara húmeda cubierta (placa Petri de plástico) a 18 ° C hasta que los embriones se desarrollan en la etapa embrionaria deseado.
- Use la sonda para eliminar los embriones de la cinta de doble cara y empujarlos al borde de la hoja de la cubierta.
Lavado de los embriones de la diapositiva en un frasco de colección con una malla de nylon en la parte inferior con heptano, lavar 3 veces con PBT.
Embriones Dechorionate en el 50% de lejía durante 5 minutos, y lavar 3 veces con PBT.
La transferencia de embriones a partir de la colección vial a un pedazo de malla de nylon, y luego sumergir la malla de nylon en la solución de fijación (5 ml de heptano, 4.5ml de PBS, 0,5 ml de formaldehído 37%) para liberar los embriones. Fix embriones en la solución fijadora durante 30 minutos.
Devitellinize embriones con metanol, la transferencia de embriones en un tubo eppendorf y inmunotinción los embriones a través de protocolos estándar. - Los embriones también pueden desarrollarse a la etapa larval adecuado.
- Preparar un portaobjetos con una gota de aceite de halocarbonos 700 en el centro
- Transferencia de una larva a la diapositiva, ponga una hoja de cubierta en la parte superior
- Observar las larvas bajo el microscopio de campo claro.
7. Los resultados representativos:
Un ejemplo de dsRNA derribar dysfusion (días) de genes en embriones Drosophlia se muestra en la Fig. 1. GFP-dsRNA embriones inyectados son el control negativo. Disfunción es un factor de transcripción bHLH PAS expresa en las células de fusión traqueal. GFP-dsRNA embriones inyectados mostrar fusión traqueal normal, y la proteína Dis está presente en las células de fusión (Figura 1). Por otro lado, la dis-dsRNA inyecta embriones muestran la fusión no poder, y las proteínas Dis no están presentes en las células de fusión (fig. 1B). Cuando se inyecta dsRNA embriones se desarrollan en estado larvario, las larvas disfunción dsRNA inyectados mostraron la fusión no poder (Fig.1D) en comparación con las buenas prácticas agrarias dsRNA control inyectados negativo (fig. 1C). Estos resultados mostraron eficaces tumbar de la expresión endógena del gen disfuncional por dsRNA inyección en embriones de Drosophila
Figura 1. Eliminación de la función de disfunción de la dis-RNAi revela traqueal fusión defects. Embriones blastodermo (w 1118) fueron inyectados con las buenas prácticas agrarias dsRNA (control negativo) o disfunción dsRNA y se analizaron para detectar defectos traqueal. (A) Fase 16 embriones inyectados con las buenas prácticas agrarias dsRNA y teñidas con α-Dis y MAb 2A12 que las manchas de la luz traqueal. Prominente que se muestra es el lateral del tronco, que se ha fundido. Las flechas apuntan a las células troncales de fusión lateral dis-positivo. (B) Etapa 16 embriones inyectados con disfunción dsRNA y teñidas con α-Dis y 2A12 MAb. El embrión mostró una falta de fusión lateral del tronco (el asterisco indica la ubicación normal de una fusión lateral del tronco en los embriones de control). No se observan células dis-positivos fueron observados, lo que indica que la dis-ARN supresión efectiva de proteínas Dis. (C y D) En segundo lugar, instar las larvas, ya sea con las buenas prácticas agrarias dsRNA o disfunción dsRNA fueron examinadas por microscopía de campo brillante para los defectos traqueal. (C) Sitios de la fusión se señalan con un asterisco en las buenas prácticas agrarias dsRNA larvas de control de inyección. (D) El lateral del tronco no se funden en las larvas de la dis-ARN inyectada, (*) indica la posición normal de una fusión lateral del tronco.
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Discusión
La inyección de dsRNA presente método permite aquí un análisis muy sensible y rápida de la función de genes en el desarrollo de Drosophila traqueal. Este método potencialmente puede ser aplicado para analizar la función de genes de otros tejidos y el desarrollo de órganos.
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la tripulación de Stephen dysfusion cDNA de anticuerpos, Dis y moscas w 1118.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aceite de halocarbono 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Bomba piezoeléctrica Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micropipetas | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microcargadores | Eppendorf | 930001007 |
Referencias
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- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
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- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
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