Colonia de levaduras Método de anidamiento

Summary

Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.

Abstract

Patrón de los diferentes tipos de células en embriones es un mecanismo clave en el desarrollo de los metazoos. Comunidades de microorganismos, tales como colonias y biofilms también muestran patrones de tipos de células. Por ejemplo, en el de levadura de S. cerevisiae, células y las células esporuladas pseudohyphal no están distribuidas uniformemente en las colonias. La importancia funcional de los patrones y los mecanismos moleculares que subyacen a estos modelos son aún poco conocidos.

Uno de los retos con respecto a la investigación de patrones de tipos de células en las colonias de hongos es que a diferencia del tejido metazoos, las células en las colonias son relativamente débilmente unidas entre sí. En particular, las colonias de hongos no contienen el mismo nivel amplio de la matriz extracelular en la mayoría de los tejidos. Aquí nos informe sobre un método para la inclusión y corte de colonias de levaduras que revela los patrones interior de tipos de células en estas colonias. El método puede ser usado para preparar secciones gruesas (0,5 μ) es útil para microscopía óptica y secciones delgadas (0,1 μ) adecuada para la microscopía electrónica de transmisión. Células ascos y pseudohyphal se pueden distinguir fácilmente de las células de levadura ovoide por microscopía de luz, mientras que la estructura interior de estas células puede ser visualizado por EM.

El método se basa en los alrededores de las colonias con agar, infiltrándose en ellos con el medio de Spurr, y luego el corte. Las colonias con un diámetro en el rango de 1-2 mm son adecuados para este protocolo. Además de visualizar el interior de las colonias, el método permite la visualización de la región de la colonia que invade el agar subyacente.

Protocol

1. Colonia El aislamiento y la fijación

1. Incubar 300 colonias en un medio de agar durante el tiempo indicado (una colonia aislada debe ser de 1-2 mm de diámetro).
2. Retire la colonia (boca arriba) y medio subyacente utilizando una espátula.
3. Coloque varias gotas de 2% de agar 42 ° C en un portaobjetos con 1 mL Pipetman punta y de inmediato el lugar de colonias en el rostro de agar antes de que se solidifica.
4. Coloque varias gotas de 2% de agar 42 ° C en la colonia y dejar que se solidifique.
5. Use guantes para todos los pasos en lo que resta de este protocolo
6. Bloque de corte con cuchilla de afeitar y colocarlos en....

Discussion

El método presentado revela las estructuras interiores de las colonias. Debido a que el método es eficaz en la determinación de patrones de tipos de células en una variedad de S. cerevisiae con morfologías diferentes colonias, y también en una especie relacionada S. paradoxus ^5, el método también es probable que trabajar en una amplia gama de hongos y otros microorganismos.

Un paso fundamental para el éxito del método es asegurar que toda la colonia, incluyendo la parte s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetróxido de osmio	Ciencias de la microscopía electrónica	RT 19152
Moldes de inclusión de silicona	Fisher Scientific	NC 9975029
Resina de epóxido cicloalifático	Ciencias de la microscopía electrónica	RT 15004	ERL 4221
Resina epoxi	Ciencias de la microscopía electrónica RT	13000	DER 736
Anhídrido succínico de nonenilo	Ciencias de Microscopía Electrónica	RT 19050	NSA
2-Dimetilamina– etanol	Ciencias de la microscopía electrónica	RT 13300	DMAE
Medios de montaje	KPL Inc	71-00-16
Rueda giratoria	Ted Pella, Inc.	Microtomo Pelco 1055
	Leica Microsystems	Ultracut S