En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Resumen

En este vídeo, se demuestra la visualización de la translocación de la PKC en células vivas mediante PKC marcado con fluorescencia.

Resumen

La proteína quinasa C (PKC) son serina treonina cinasas que juegan un papel central en la regulación de una amplia variedad de procesos celulares, tales como el crecimiento celular y el aprendizaje y la memoria. Hay cuatro familias conocidas de las isoformas de PKC en los vertebrados: PKC clásicas (α, βI, βII y γ), el tipo de novela que PKC (ε y η), la novela de tipo II PKC (δ y θ), y PKC atípicas (ζ y ι ). La PKC clásicas son activados por Ca ^{2 +} y diacylclycerol (DAG), mientras que las PKC nuevas son activadas por DAG, pero son Ca ^{2 +-independiente.} Las PKC atípicas son activados por Ca ^{2 +} ni ni DAG. En Aplysia californica, nuestro sistema modelo para estudiar la formación de la memoria, hay tres isoformas específicas del sistema nervioso PKC uno de cada clase principal, a saber, la PKC convencionales APL I, el tipo de novela que PKC Apl II y de la PKC atípicas APL III. PKC son lípido quinasas activadas y por lo tanto la activación de la PKC clásicas y nuevas en respuesta a señales extracelulares con frecuencia se ha correlacionado con translocación de PKC desde el citoplasma a la membrana plasmática. Por lo tanto, la visualización de la translocación de la PKC en tiempo real en células vivas se ha convertido en una herramienta invaluable para dilucidar las vías de transducción de señales que conducen a la activación de la PKC. Por ejemplo, esta técnica ha permitido que nos permite establecer que las diferentes isoformas de PKC trasladar bajo diferentes condiciones de mediar en distintos tipos de plasticidad sináptica y que la serotonina (5-HT) activación de la PKC Apl II requiere la producción de los DAG y ácido fosfatídico (PA) para translocación ^01/02. Es importante destacar que la capacidad de visualizar la misma neurona en repetidas ocasiones nos ha permitido, por ejemplo, para medir la desensibilización de la respuesta de la PKC en exquisito detalle ^3. En este vídeo, que muestran cada paso de la preparación de Sf9 cultivos celulares, cultivos de neuronas sensoriales Aplysia se han descrito en otro artículo de vídeo ^4, expresando PKC marcado con fluorescencia en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia y en vivo de imágenes de la translocación de PKC en respuesta a activadores diferentes utilizando microscopía de barrido láser.

Protocolo

1. Preparación y mantenimiento de cultivos celulares en monocapa Sf9

1. Sf9 cultivo celular y el mantenimiento se lleva a cabo en una campana de cultivo de tejidos.
2. Sf9 células derivan de células de Spodoptera frugiperda ovario (Sf21 células) y se pueden comprar en las células congeladas en la gracia de los medios de Invitrogen.
3. Lugar 8 ml de medio de insectos de Grace, complementada (1X), a los cuales el 30% de suero fetal bovino (FBS) se ha añadido en un 75 cm ² frasco de cultivo celular con el cuello inclinado.
4. Descongelar el tubo congelado de células Sf9 rápidamente en un baño de agua 37 ° C moviendo el tu....

Discusión

Hemos descrito una técnica de translocación de PKC imagen marcado con fluorescencia en tiempo real en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia. Sf9 proporcionar un sistema simple a la translocación de PKC imagen desde el cultivo y la transfección de ellos es bastante sencillo. Por el contrario, la microinyección de las neuronas sensoriales Aplysia toma algún tiempo para dominar, hasta unos pocos meses. Dificultades relacionadas con esta técnica son la obstrucción de los electrodos. Filtrado de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células Sf9 congeladas	Spodoptera frugiperda células ováricas	Invitrogen	B825-01
Gracia’Medio para insectos suplementado (1X), líquido	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	11605-094	Utilizar para cultivar células Sf9
Corning 75 cm2 frasco de cultivo celular con cuello inclinado	Herramienta	Corning	430720	Utilizar para cultivar células Sf9
Suero bovino fetal	Reactivo	CanSera	CS-C08-500	Suplemento Grace’s medio con FBS antes de usarlo
Jeringa	Herramienta	BD Biosciences	309604	Usar para filtrar la solución de verde rápido
Jeringa	Herramienta	BD Biosciences	309602	Usar para filtrar la solución de ADN plasmídico / Azul de metileno
Filtrar	Herramienta	Corning	431229	Usar para filtrar la solución de verde rápido
Filtrar	Herramienta	Corning	431212	Usar para filtrar la solución de ADN plasmídico / azul de metilo
Plato de Vidrio con Fondo Transparente	Herramienta	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Utilizar para cultivar células Sf9 antes de la transfección y el análisis por imágenes
Reactivo Cellfectin II	Reactivo	Invitrogen	10362-100	Utilizado para expresar PKC marcadas con fluorescencia en células Sf9
Fast Green FCF	Reactivo	Sigma-Aldrich	F-7252	Utilizar para visualizar la microinyección de solución de ADN plasmidial en Aplysia neuronas sensoriales
Capilares de vidrio de pared delgada	Herramienta	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Utilice para hacer micr–electrodos para microinyección
Punta de pipeta Microloader	Herramienta	Eppendorf	CA32950-050	Autoclavar antes de usar para llenar el micropipeta–Electrodos para microinyección
PV820 PicoBomba Neumática	Herramienta	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Parte de la estación de microinyección
Micr–soporte para electrodo	Herramienta	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Utilice para sostener el micrómetro–electrodo
Micromanipulador	Herramienta	Sutter Instrument Co.	MP-85	Utilice para posicionar el micrómetro–electrodo en los tres ejes