Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.
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Artículo de método
Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad de Lyme es una infección producida por la espiroqueta Borrelia burgdorferi patógeno, que se mantiene en la naturaleza por un ciclo de infección por garrapatas de roedores 1. Un modelo murino transmitida por garrapatas 2 ha sido desarrollado para estudiar la enfermedad de Lyme en el laboratorio. Mientras que las garrapatas ingenuo puede estar infectada con B. burgdorferi por la alimentación de los ratones infectados, el proceso de muda lleva varias semanas o meses en completarse. Por lo tanto, el desarrollo de las técnicas de infección más rápida y eficiente de garrapatas, tales como un procedimiento basado en la microinyección, es una herramienta importante para el estudio de la enfermedad de Lyme 3,4. El procedimiento requiere sólo unas horas para generar garrapatas infectadas y permite el control sobre la entrega de cantidades iguales de las espiroquetas en una cohorte de garrapatas. Esto es particularmente importante en la generación de B. garrapatas burgdorferi infectados por el proceso natural de alimentación con ratones no garantiza 100% la tasa de infección y, posiblemente, resultados en la variación de la carga de patógenos entre las garrapatas alimentadas. Por otra parte, la microinyección se puede utilizar para infectar a las garrapatas con B. burgdorferi aislados en los casos en que una cepa atenuada es incapaz de establecer la infección en ratones y por lo tanto no puede ser adquirida de forma natural por las garrapatas 5. Esta técnica también se puede utilizar para ofrecer una variedad de otros materiales biológicos en las garrapatas, por ejemplo, anticuerpos específicos o de ARN de doble cadena 6. En este artículo, vamos a demostrar la microinyección de garrapatas ninfas con in vitro cultivados en B. burgdorferi. También se describe un método para la localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino de garrapatas mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia.
Protocolo
1. Microinyección de ninfas garrapatas Ixodes scapularis
1. Preparación de las agujas
- Fabricar varias agujas de microinyección de calefacción y tirar de un tubo de vidrio capilar mm (Instrumentos del Mundo de precisión) en un dispositivo de cristal micropipeta extractor (Narishige). Retire con cuidado los tubos capilares frágiles.
- Tienda sacó agujas (con la punta hacia arriba) en la cinta adhesiva en una placa de Petri.
2. La preparación de B. burgdorferi
- Crecer B. burgdorferi en medios de cultivo BSK 7 hasta una concentración de alrededor....
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Discusión
Aquí se demuestra un procedimiento basado en la microinyección de infección rápida y eficiente de las garrapatas Ixodes ninfa con el patógeno bacteriano B. burgdorferi. También describe un procedimiento confocal de inmunofluorescencia para la detección de B. burgdorferi en el intestino de garrapatas en el lugar. A pesar de nuestra demostración consiste en tripa de ninfa, procedimientos similares se aplican también a otras etapas de desarrollo de las garrapatas, tales como larvas o adultos
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos sinceramente a los miembros del laboratorio Pal para asistencia en la preparación de esta manifestación. Este estudio fue apoyado por subvenciones PHS AI076684 y AI080615 de los NIH / NIAID.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos capilares de vidrio | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Tractor vertical de vidrio | Narishige International | PC-10 | |
| Cámara de recuento Petroff-Hausser | Hausser Scientific | 3900 | |
| Puntas de micropipeta Microloader | Eppendorf | 930001007 | |
| Microinyector Femtojet | Eppendorf | 920010504 | |
| Control pedal FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific | BP665-1 | Sterilizado por filtración |
Referencias
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. ....
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Reimpresiones y permisos
