Artículo de método

Glicol eficiente de polietileno (PEG) de la transformación mediada por Moss Physcomitrella patens

DOI:

10.3791/2560

⸱

19 de abril de 2011

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute- WPI

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un método simple y eficiente para transformar Physcomitrella pantens Protoplastos se describe. Este método es una adaptación de los protocolos para Physocmitrella Protonemal protoplastos y Arabidopsis Mesófilo de transformación de protoplastos 1.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Haciendo que el protoplastos

  1. Añadir 9 ml de 8% de manitol a una placa de Petri.
  2. Usando una espátula, coloque siete días de edad musgo 2-3 PPNH4 placas de 5 - en la placa de Petri que contienen manitol.
  3. Añadir 3 ml de 2% Driselase (Sigma D9515-25G) para la placa de Petri.
  4. Incubar la placa de Petri a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora.
  5. Filtrar la suspensión de protoplastos a través de una malla de 100 micras (BD Falcon 352 350).
  6. Giro se filtró la suspensión a 250 g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
  7. Vuelva a suspender los protoplastos con mucha suavidad, con 500 l de 8% de manitol.
  8. Añadir 9,5 ml de manitol al 8% en el tubo de la cultura. Asegúrese de protoplastos se suspendió totalmente.
  9. Repita la filtración y la suspensión re-pasos (1.6, 1.7 y 1.8) dos veces más.
  10. Tomar 10 l de la solución de protoplastos y el recuento de los protoplastos en un hemocitómetro.
  11. Multiplicar el número de protoplastos en un área de 16 cuadrados por 10.000 para obtener el número de protoplastos por ml (ver Figura 1).

2. Transformación

  1. Haga girar la suspensión de protoplastos a 250 g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
  2. Vuelva a suspender los protoplastos en una solución de MMG en la concentración de 1,6 millones de protoplastos / ml.
  3. Incubar la suspensión de protoplastos a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  4. Añadir 600 l de suspensión de protoplastos en un tubo de cultivo que contienen 60 mg de ADN. Agitar el tubo suavemente.
  5. Añadir 700 L de PEG / Ca solución en la mezcla de protoplastos / ADN. Agitar el tubo suavemente hasta que la mezcla es homogénea todo.
  6. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  7. Durante este período de espera, la cubierta PRM-B placas con papel de celofán (80 mm de diámetro, los círculos, AA Embalaje Limited, Reino Unido), permitirá celofán para hidratar la superficie de la placa por lo menos durante 5 min.
  8. Con una espátula, eliminar las burbujas de aire atrapado entre el celofán y la placa.
  9. Diluir la mezcla con 3 ml de solución W5.
  10. Haga girar la mezcla a 250 g durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
  11. Vuelva a suspender los protoplastos en derretida 2 ml de PRM-T (antes de añadirla a los protoplastos se puede mantener esta solución líquida a 42 ° C). Placa 1 ml de volver a suspender los protoplastos por PRM-B plato cubierto por papel de celofán. Envuelva las placas con microporos (3M, Cuidado de la Salud). Mantener las placas a 25 ° C en cámara de crecimiento.
  12. Por otra parte, los protoplastos se resuspendieron en 1 ml de medio de recubrimiento líquido y plateado 0,5 ml en una placa de PRM-B cubiertas con celofán. Esto permite una regeneración más rápida, pero el número de plantas de regeneración es baja.
  13. Cámara de crecimiento está listo para una hora 16. luz y 8 horas. ciclo de oscuridad.
  14. Mueva el celofán en una placa nueva selección cuatro días después de la transformación.

3. Los resultados representativos:

Un ejemplo de la transformación se muestra en la Figura 2. El ADN utilizado en este ejemplo fue una superenrollado 7,8 kb plásmido que lleva una cinta de resistencia a higromicina. La cantidad de protoplastos plateado se redujo a 50% para la fotografía. Las fotos fueron tomadas dos semanas después de que las plantas fueron trasladadas a las placas de selección. La eficiencia de transformación no se ve afectada por la concentración de ADN de hasta 60 mg. Una mayor concentración de ADN son perjudiciales para la eficiencia de transformación. Los datos mostraron que este método proporciona resultados consistentes en un amplio rango de cantidades de ADN. Este método también puede generar transformantes estables efectivamente como se muestra en la Tabla 1, podemos obtener unos 4 transformantes estables por microgramo de ADN lineal, que es mucho mayor que lo reportado previamente 14.

También hemos probado el efecto de choque de calor en la eficiencia de transformación mediante la transformación de un plásmido superenrollado portadores de un gen para una proteína fluorescente como un marcador. El choque térmico se llevó a cabo 10 minutos después de la incubación a temperatura ambiente (en el Paso 2.6) mediante la incubación de la mezcla en un baño de agua a 45 ° C durante 3 minutos. La mezcla se incubó en un baño en la habitación la temperatura del agua inmediatamente después de choque térmico durante 17 min. Los resultados se registraron 22 horas después de la transformación. Las proporciones de los transformantes obtenidos con y sin choque térmico son muy similares (~ 25%), pero se observó un efecto adverso de choque térmico sobre la viabilidad de los protoplastos (datos no mostrados).

figure-protocol-1
Figura 1. Vista de protoplastos en hemocitómetro. La sección necesaria para el recuento de protoplastos se indica mediante un cuadrado rojo. Tenga en cuenta las 16 plazas necesarias para el recuento de protoplastos (ver 1.11), la imagen muestra un recuento de 24 de protoplastos (240.000 células / ml).

figure-protocol-2
Figura 2. Fotos de 18 días transitoria transformantes de edad. Protoplastos se transformada con la cantidad indicada de plásmido superenrollado. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.

Cantidad de ADN (g) La eficiencia (tranformants ADN / mg)
15 de plásmido superenrollado 120 ± 24
30 de plásmido superenrollado 145 ± 54
60, plásmido superenrollado 121 ± 60
120, plásmido superenrollado 71 ± 38
60, plásmido linealizado 4 ± 1

Tabla 1. Transformación de la eficiencia en diferentes cantidades de ADN.

Discusión

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El método aquí presentado permite una transformación de ADN directa y consistente en Physcomitrella patens protoplastos. Este método fue desarrollado originalmente para el 1 de Arabidopsis, pero aquí hemos demostrado que funciona bien con protoplastos de Physcomitrella patens, una planta simple y diferente. Por lo tanto, este método se puede aplicar a otras especies de plantas con modificaciones menores. Posibles modificaciones para la optimización incluyen la concentración de protoplastos en MMG, tiempo de incubación en la solución de MMG y PEG / Ca. Optamos por utilizar 60 mg de ADN en nuestros experimentos de rutina debido a que el número de transformantes se incrementa linealmente con la concentración de ADN hasta este momento (Tabla 1). Podríamos obtener unos 7.000 transformantes transitorios o 200 transformantes estables en una única de 60 mg la transformación del ADN, que permite la detección y análisis de una gran población de plantas.

Los protoplastos transformados puede ser extendido con un medio líquido o placas PRM-T. Aunque la eficiencia de la regeneración es más baja cuando el medio de recubrimiento líquido se utiliza, se elige este método cuando los protoplastos se transformaron con plásmidos superenrollado. Como se muestra en la Tabla 1, las transformaciones de hecho con el ADN de plásmido superenrollado generar transformantes muchos más y por lo tanto, podemos obtener un gran número de plantas con el medio de recubrimiento líquido. Además, la difusión de protoplastos con el medio chapado líquido permite una regeneración más rápida, lo cual es importante para los experimentos con fenotipos transitoria, como RNAi tumbar experimentos 9,15. Además de la ausencia de agar para el aislamiento de la parte superior permite planta fácil de inmunotinción y RT-PCR 9,15.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV es apoyado por la NSF (IOS 1002837)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Ingrediente
PPNH 4 1,84 mM KH 2 PO 4
3,4 mM de Ca (NO 3) 2
1 mM MgSO 4
2,72 mM de tartrato de diamonio
54 M FeSO 4 .7 H 2 O
9,93 M H 3 BO 3
1,97 M MnCl2 0,4 H 2 O
0,23 M CoCl 2 .6 H 2 O
0,19 M ZnSO4. 7H 2 O
0,22 M CuSO 4. 5H 2 O
0,10 M Na 2 MoO 4 .2 H 2 O
0,168 M de KI
Agregar 0,7% de agar para un medio sólido.
PRM-B PPNH 4 con 6% de manitol y el 0,8% de agar. Agregar 10 ml de CaCl2 1M a 1 L antes de verter las placas.
PRM-T PPNH 4 con 6% de manitol y el 0,6% de agar. Añadir 0,5 ml de CaCl2 1M a 50 ml antes de su uso.
Media Revestimiento líquido PPNH 4 con el 8,5% de manitol, sin agar. Añadir 0,5 ml de CaCl2 1M a 50 ml antes de su uso.
2% Driselase Añadir 4 g de Driselase (Sigma D9515-25G) a 200 ml de 8% de manitol. Revuelva suavemente durante 30 minutos. a temperatura ambiente, incubar 30 min. a 4 ° C, y agite suavemente durante 5 minutos. a temperatura ambiente. Girar 2.500 g durante 10 minutos, descartar pellet. Filtro de 0,22 micras, con y almacenar congelados alícuotas de 10 ml. Descongelar en un baño en la habitación la temperatura del agua antes de su uso.
MMG 0,4 M manitol
15 mM MgCl 2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG / Ca 4 g PEG4000
3 ml de H 2 O
2,5 ml de 0,8 M de manitol
1 ml de CaCl2 1M
W5 154 mM NaCl
125 mM de CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5.7)

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
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  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
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