Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Summary

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Abstract

Los cambios dinámicos en la concentración de calcio intracelular en respuesta a diversos estímulos regula muchos procesos celulares como la proliferación, diferenciación y apoptosis ^1. Durante la acumulación de calcio en la apoptosis, en las mitocondrias promueve la liberación de factores pro-apoptóticos de la mitocondria en el citosol ^2. Por lo tanto, de interés para medir directamente el calcio mitocondrial en las células vivas in situ durante la apoptosis. De alta resolución de imágenes fluorescentes de las células de carga con doble excitación radiométrica y no radiométrico, colorantes sintéticos de calcio indicador se ha demostrado ser una herramienta fiable y versátil para estudiar diversos aspectos de la señalización del calcio intracelular. Medición de los flujos de calcio citosólico uso de estas técnicas es relativamente sencillo. Sin embargo, la medición de los niveles de calcio en las células intramitocondrial intacta a través de indicadores sintéticos de calcio, tales como Rhod-2 y Rhod FF-es más difícil. Indicadores sintéticos dirigidos a la mitocondria han mitigado las respuestas a los aumentos de repetitivo en el calcio mitocondrial, y alterar la morfología mitocondrial ^3. Adicionalmente, los indicadores sintéticos tienden a salirse de la mitocondria durante varias horas que los hace inadecuados para experimentos a largo plazo. Por lo tanto, genéticamente codificados indicadores de calcio basado en la proteína verde fluorescente (GFP) ⁴ o ⁵ aequorin dirigidos a la mitocondria han facilitado en gran medida de la dinámica del calcio mitocondrial. Aquí se describe un método sencillo para medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial en respuesta a diferentes estímulos. El método se basa en la microscopía de fluorescencia de 'radiométrica-pericam ", que es selectivamente a las mitocondrias. Radiométrica pericam es un indicador de calcio basado en una fusión de circularmente permutado proteína amarilla fluorescente y calmodulina ^4. Unión del calcio a pericam radiométrica provoca un desplazamiento de su punto máximo de excitación de 415 nm a 494 nm, mientras que el espectro de emisión, que alcanza su máximo alrededor de 515 nm, se mantiene sin cambios. Radiométrica pericam une un ion de calcio solo con una constante de disociación in vitro de ~ 1,7 M ^4. Estas propiedades de pericam radiométrica permite la cuantificación de los cambios rápidos y de largo plazo en la concentración de calcio mitocondrial. Además, se describe la adaptación de esta metodología a un nivel de campo amplio microscopio imágenes de calcio con los conjuntos de filtros comúnmente disponibles. El uso de dos agonistas diferentes, los agonistas purinérgicos ATP y de inducción de apoptosis estaurosporina de drogas, demuestran que este método es apropiado para observar los cambios en la concentración de calcio mitocondrial, con una resolución temporal de segundos a horas. Por otra parte, también demuestran que pericam radiométrica es también útil para la medición de la fisión mitocondrial / fragmentación durante la apoptosis. Por lo tanto, pericam radiométrica está particularmente bien adaptado para la continua a largo plazo la medición de la dinámica del calcio mitocondrial de la apoptosis.

Protocol

1. Pericam-mt Transfección y preparación de células.

1. Placa de células HeLa la noche antes de la transfección en cubreobjetos de vidrio estériles colocados en una placa de cultivo estándar de 6 pocillos.
2. Preparar ADN / Lipofectamine 2000 complejos como sugerido por el fabricante (Invitrogen). Usamos 4 mg del vector de expresión radiométrica-pericam-mt y 10 l de Lipofectamine 2000 diluido en 0,5 ml de Opti-MEM para cada pozo. Las células deben ser confluentes ~ 70% antes de la transfección.
3. Vuelva a colocar HeLa medios de cultivo (Dulbecco modificado águilas medio, 10% de SFB, penicilina / estreptomicina) en cada pocillo con 1,5 ml del mismo medio sin antibióticos.
4. Añadir los complejos ADN / Lipofectamine a cada pocillo para ser transfectadas. Mezclar suavemente con la oscilación y se incuba durante 4 horas en un cultivo celular incubadora a ³⁷ º C, 5% de CO _2.
5. Reemplazar a los antibióticos sin los medios de comunicación con los medios de cultivo con antibióticos. Permiten a las células para expresar pericam radiométrica por 1-2 días antes de la imagen.

2. Microscopio de instalación y de adquisición de imágenes

1. Coloque un cubreobjetos con células HeLa en una cámara de imágenes apropiadas con una solución de imagen: 107 mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm de _MgCl2, 1 mM CaCl _2, la glucosa 11,5 mm, 0,1% de albúmina de suero bovino, 20 mM HEPES y 7,2. Nuestro laboratorio utiliza la cámara del celular Attofluor de Invitrogen. Monte la cámara de imágenes en una etapa microscopio invertido.
2. Encontrar un área de interés que contienen una o más células que expresan pericam radiométrica con un 40x (o superior) objetivo de inmersión en aceite. Hemos encontrado que pericam radiométrica es menos resistente a photobleaching a 380 nm, y por lo tanto utilizamos esta longitud de onda para identificar las células adecuadas. Para las imágenes adquiridas en la Figura 1, un objetivo Nikon Superfluor 40X con una apertura numérica 1.3 se utilizó. Objetivos más altos de aumento también podría ser adecuado (60-100x). Filtros de excitación utilizada se Chroma Technology filtros D380/30x (380 + / - 30 nm) y D495/10 (495 + / - 5 nm), divisor se 505DCXR (505nm paso largo), y la emisión de filtro se HQ535/50m (535 + / - 25 nm).
   Nuestro microscopio usado para adquirir las imágenes en la Figura 1 se compone de una Nikon TE2000 microscopio invertido equipado con un Roper Científico Coolsnap HQ enfriado cámara CCD, Ludl MAC6000 rápida rueda de filtros y un cambiador, y una adquisición de datos MetaFluor y software de análisis. Este protocolo se puede adaptar a cualquier punto de vista amplio campo del microscopio con los filtros apropiados y software capaz de capturar y procesar imágenes radiométrica.
3. Configurar el software para la excitación de doble uso de los 495 nm y 380 filtros. Unión del calcio a pericam radiométrica aumenta la absorbencia a 495 nm, con lo que la relación debe ser configurado para ser 495 nm/380 nm.
   Radiométrica pericam tiene un libre de calcio pico de excitación a 415 nm ^4. En este protocolo le sugerimos que utilice un filtro de 380 nm sólo porque es omnipresente en la mayoría de los laboratorios de imagen de calcio. Si un filtro de 410 nm está disponible, es preferible que el filtro de 380 nm.
4. Adquirir imágenes secuencialmente como alternativa interesante a 495 y 380 nm. Adquirir imágenes de los niveles de calcio de referencia por lo menos 30 s antes de la aplicación de agonistas a través de un aparato de perfusión. Además de marcar el tiempo para cada agonista. Los tiempos de exposición y los intervalos de adquisición debe ser optimizado para evitar photobleaching al tiempo que permite suficiente ejemplo resolution.For temporal, para la dinámica de calcio semi-rápido seguimiento en respuesta a la estimulación agonista, las imágenes fueron adquiridas cada dos segundos en las figuras 1B y C. Mucho más rápido las tasas de adquisición También es posible ^6. A largo plazo después de la administración de imágenes estaurosporina fue adquirida con un intervalo más largo (30 años) entre las adquisiciones (Figuras 1 D y E).

3. Procesamiento de imágenes y análisis

1. Una vez que el experimento está completo, las imágenes obtenidas pueden ser analizados fuera de línea. Definir regiones de interés (ROI) en la que desea monitorear los cambios en los niveles de calcio. Utilice un retorno de la inversión seleccionados dentro de un área vacía del campo para restar el fondo si es necesario. Cabe señalar que las mitocondrias son muy móviles y dinámicas, y la extrapolación de los acontecimientos en una sola mitocondria durante largos períodos de tiempo no siempre es posible. Por lo tanto, teniendo en cuenta la movilidad de alta de este orgánulo en algunos tipos de células, la selección de retorno de la inversión deben ser monitoreados cuidadosamente. Además, como se evidencia en la Figura 1, la respuesta de las mitocondrias heterogénea a diversos estímulos. Por tanto, es importante analizar los datos en línea y monitorear RO1 colocación en un fotograma a fotograma. Una descripción detallada de la medición de calcio mitocondrial en la mitocondria muy móviles ha sido descrito en otra parte ^7.
2. Obtuvieron mediciones de la relación de retorno de la inversión se pueden importar en Excel o similar graphingsoftware. Los datos pueden ser presentados como una huella que representan los cambios en los niveles de calcio mitocondrial en una sola celda o mitocondria sola, o un promedio de flseñales de fluorescencia de retorno de la inversión de varios. También hemos utilizado esta técnica para medir los niveles promedio de calcio mitocondrial en una población de linfocitos en la apoptosis inducida por Fas ligando ^8.

4. Los resultados representativos:

Figura 1. (A) la localización subcelular de radiométrica-pericam-mt. Esta primera imagen muestra en vivo de células HeLa que expresan radiométrica-pericam-mt. La segunda imagen muestra la tinción fluorescente selectiva mitocondria-dye MitoTracker CMXRos Roja. La fluorescencia de color amarillo en la imagen fusionada demuestra co-localización de radiométrica-pericam-mt y fluorescencia MitoTracker. (B) una serie de relación pseudocolor (495:380 nm) imágenes de 4 células HeLa que expresan mt-radiométrica pericam tratados con 10 mM ATP . (C) Cuantificación de los cambios en los niveles de calcio mitocondrial en la región de interés (ROI) se indica en (B) tratados con 10 mM ATP. (D) de la serie de la relación de pseudocolor (495:380 nm) imágenes de una célula HeLa expresar mt -radiométrica pericam tratados con estaurosporina M 0.5. Heterogeneidad en la respuesta de calcio en las mitocondrias individuales es evidente, así como una fragmentación significativa de las mitocondrias en 60 minutos. Algunos mitocondrias aumenta oscilatorio en calcio (cabeza de flecha blanca), mientras que otros no muestran cambios significativos en el nivel de calcio (cabeza de flecha amarilla). (E) Cuantificación de los incrementos en los niveles globales de calcio mitocondrial en una sola célula HeLa después de la inducción de la apoptosis con 0,5 M estaurosporina.

Discussion

Aquí presentamos un método muy sencillo para medir el calcio mitocondrial utilizando mitocondrial orientada pericam radiométrica. Como se muestra en la Figura 1, la utilización de la óptica de campo amplio con deconvolución no se puede ver fácilmente cada mitocondrias en las células HeLa con aceptable relación señal-ruido. Esto se debe a las células HeLa, como la mayoría de las células en cultivo, se aplanan de manera significativa cuando adherente obviando la necesidad de microscopía confocal u otro equipo especializado. Hemos encontrado resultados similares en las células Jurkat conforme con poli-lisina cubreobjetos recubiertos ^8. A diferencia de los métodos de uso de tintes, también es posible controlar de forma no invasiva los niveles de calcio mitocondrial durante horas utilizando genéticamente codificados indicadores de calcio, tales como radiométrica pericam (Figura 1). Esto es especialmente importante cuando se analiza el calcio mitocondrial en la muerte celular. Por otra parte, también es posible visualizar la fisión / fragmentación de las mitocondrias durante el proceso de apoptosis. Como se muestra en las figuras 1D y E, el tratamiento estaurosporina causa un incremento lento de calcio en las subpoblaciones de selección de las mitocondrias que culmina a 20 minutos. Los niveles de calcio volver a bajar concomitante con la fragmentación mitocondrial antes de subir otra vez 2 horas después del tratamiento. Esto es consistente con las ondas lentas en el calcio citosólico inducida por el tratamiento estaurosporina mide utilizando Fura-2 ^9. Así, la información cinética importantes se pueden obtener lo que no es posible con los métodos que emplean las mediciones estáticas. A pesar de que han presentado razones y no las concentraciones de calcio en la figura 1, es posible calibrar el sensor in situ para el cálculo de los niveles absolutos de calcio ^{4, 10.} Una advertencia importante a considerar es que pericam radiométrica es sensible a un pH de ^{4, 10.} Dado que tanto los niveles de pH citosólico y mitocondrial puede cambiar drásticamente durante la apoptosis ^11, esta es una consideración importante. La titulación de pH en las mitocondrias aisladas pericam expresar demostrar que el aumento de [H ^+] aumenta la emisión de pericam cuando se excita a 495 nm, con poco efecto sobre la emisión estimulada por la excitación a 410 nm, una propiedad que ha sido explotada para medir simultáneamente el calcio mitocondrial y pH ^12. Por lo tanto, de manera selectiva el control de emisiones con 410 nm de excitación proporciona un medio para controlar el calcio no ratiometrically mitocondrial con preocupación reducción de pH. Finalmente, el protocolo que aquí se presenta sólo requiere acceso a un microscopio de epifluorescencia con filtros estándar ampliamente disponible, con lo que esta técnica accesible a la mayoría de los laboratorios.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio de imágenes de calcio fluorescente de campo amplio invertido	Nikon Instruments	MEA53310	Cualquier microscopio invertido de campo amplio equipado con filtros de excitación de 380 nm/495 nm y un filtro de paso largo y de emisión adecuado se puede adaptar fácilmente para utilizar este protocolo.
Software de imagen	Molecular Devices	Metafluor
Cámara celular Attofluor	Invitrogen	A-7816	Cualquier cámara de imagen para un microscopio invertido que permita la perfusión sería suficiente.
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	La mayoría de los reactivos/protocolos de transfección serían apropiados para estos estudios
MitoTracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512