Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

Resumen

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

Resumen

Con el fin de ejercer su función de linfocitos necesidad de salir de la sangre y migran hacia los diferentes tejidos del cuerpo. La adhesión de linfocitos a las células endoteliales y la extravasación de tejido es un proceso de múltiples pasos controlados por diferentes moléculas de adhesión (receptores homing) expresa en los linfocitos y sus respectivos ligandos (addressins) que aparecen en las células endoteliales ^{1 2.} A pesar de que la función de estos receptores de adhesión puede ser parcialmente estudiado ex vivo, la prueba definitiva de su relevancia fisiológica es para evaluar su función en vivo en la adhesión de linfocitos y la migración. Dos estrategias complementarias se han utilizado para este propósito: la microscopía intravital (IVM) y los experimentos mensajeras. A pesar de IVM ha sido esencial para definir la contribución exacta de los receptores de adhesión específicas en la cascada de adherencia en tiempo real y en diferentes tejidos, IVM es mucho tiempo y mano de obra intensiva, que a menudo requiere el desarrollo de sofisticadas técnicas quirúrgicas, es necesario el aislamiento previo de homogeneidad las poblaciones de células y permite el análisis de un solo tejido / órgano en un momento dado. Por el contrario, la competencia experimentos homing permitir la comparación directa y simultánea en la migración de los dos (o más) subconjuntos de células en el mismo ratón y también permiten el análisis de muchos tejidos y de un elevado número de células en el mismo experimento.

A continuación se describe el protocolo de la competencia clásica mensajeras para determinar la ventaja / desventaja de un tipo de célula a la casa a tejidos específicos, en comparación con una población de células control. Hemos elegido para ilustrar las propiedades migratorias de la tripa-tropical frente a las células T no destripar-trópico, debido a que la mucosa intestinal es la mayor superficie del cuerpo en contacto con el medio externo y es también el tejido extra-linfoides con los requisitos de mejor definidos migratorias . Por otra parte, trabajos recientes han determinado que la vitamina A metabolito ácido trans-retinoico (RA) es el principal mecanismo molecular responsable de la inducción al intestino receptores específicos de la adhesión (integrinas receptor de quimiocinas a4b7and CCR9) en los linfocitos. Por lo tanto, fácilmente puede generar un gran número de intestino tropicales y no tropicales los linfocitos al intestino ex vivo mediante la activación de células T en la presencia o ausencia de RA, respectivamente, que pueden ser finalmente utilizado en los experimentos competitivos homing se describe aquí.

Protocolo

1. Ex generación in vivo de células T del intestino-homing y control (ver Figura 1)

1. Aislar esplenocitos por maceración un bazo de ratones de tipo salvaje. Resuspender la suspensión de las células en PBS y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Eliminar el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por la resuspensión del sedimento de células en 4 ml de solución amortiguadora de lisis ACK durante 2-3 minutos. Después de eso, añadir 5 ml de PBS. Centrifugar durante 5 'a 400 xg y eliminar el sobrenadante.
2. Resuspender esplenocitos totales de 1 x 10 ⁶ / ml en IMDM + 10% de SFB + 50 mM 2-mercaptoetanol + penicilina / estrept....

Discusión

A pesar de que los experimentos homing proporcionar información muy valiosa acerca de la migración de la población total de células en un tejido determinado, se debe tener en cuenta que estos ensayos no analizan directamente de adhesión endoteliales y por lo tanto no discriminar en qué etapa (s) de la adhesión de varios pasos cascada (tethering / móvil, activación o pegue) un determinado receptor homing está actuando. El estándar de oro para definir el papel específico de los receptores de homing en la cascada de adhere.......

Materiales

Animales: ratones C57BL / 6 se utilizan para el aislamiento de células T. Además, CD45.1 y Thy1.1 cepas congenic están disponibles a través Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Los medios de cultivo: IMDM (medio modificado de Iscove Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) más el 10% SFB inactivado por calor (bovino fetal endotoxina en suero, baja, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (antibióticos HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / anfotericina B (Gibco) y 50 mM b-mercaptoetanol.

ACK Glóbulos Rojos tampón de lisis (RBC, 10 mM _KHCO3, 150 mM NH ₄ Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), ajustar el pH a 7,2-7,4 y almacenar a temperatura ambiente).

PBS (tampón fosfato salino, Hyclone, Waltham, MA).

La citometría de flujo (FACS) los medios de comunicación (PBS o IMDM + 2% de SFB + 5 mM EDTA). Cuando la tinción con Selectina-Fc quimeras, los medios de comunicación con 2 mM de Ca ^{+ +} se debe utilizar en todos los pasos (incluyendo la adquisición de FACS). IMDM se recomienda en este caso.

T etiquetado celular y la transferencia adoptiva: CFSE (diacetato carboxifluoresceína, succinimidil éster), CMTMR ((5 - (y-6 )-((( 4-clorometil) benzoilo) amino) tetrametilrodamina) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1.000 acciones x debe hacerse en DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) y almacenados a -20 ° C.

La activación policlonal de células T: 24 y 96 o bien placas (cultivo de tejidos tratados, de poliestireno, de fondo plano con tapa, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 50 ml de PBS, respectivamente , que contiene anti-CD3 además de los anticuerpos anti-CD28 (10 mg / ml cada uno). A continuación, las placas de cultivo se lavan dos veces con PBS y se utiliza inmediatamente para el cultivo de células T. Por otra parte, Dynabeads recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) se puede utilizar para la activación de células T en lugar de obligado placa de anticuerpos.

Citometría de flujo (FACS) de tinción: la activación policlonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptores: purificada CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), control de isotipo (IgG2a, k). Homing la piel de los receptores: P-selectina-Fc (purificada ratón P-selectina - IgG proteína de fusión, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectina Fc (E-Selectin/Fc ratón recombinante quimera, R & D Systems, Minneapolis, MN) más el correspondiente F secundario de cabra reactivo (ab ') 2 anti-IgG humana R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

El ácido trans-retinoico (Sigma, St. Louis, MO) se vuelve a suspender en etanol absoluto o DMSO con una bombilla de color amarillo o una fuente indirecta de la luz durante la preparación. Alícuotas de almacenar en frascos de vidrio a -80 ° C y protegido de la luz en todo momento. RAR-agonistas sintéticos: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).