Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.
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Artículo de método
Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones
En este artículo
Resumen
Resumen
Todo el montaje análisis inmunohistoquímico para obtener imágenes de todo el sistema vascular es fundamental para la comprensión de los mecanismos celulares de la ramificación morfogénesis. Hemos desarrollado el modelo de la piel del miembro vasculatura para estudiar el desarrollo vascular en el que un pre-existentes primitivo plexo capilar se reorganiza en una red jerárquica ramificada vascular. Todo el montaje de microscopía confocal con el etiquetado múltiple permite a la imagen robusta de los vasos sanguíneos intactos, así como sus componentes celulares incluyendo las células endoteliales, pericitos y células de músculo liso, utilizando marcadores fluorescentes específicos. Los avances en este modelo las extremidades vasculatura la piel con los estudios genéticos han permitido comprender los mecanismos moleculares del desarrollo vascular y el patrón. La piel del miembro vasculatura modelo ha sido utilizado para estudiar cómo los nervios periféricos proporcionan un modelo espacial para la diferenciación y el patrón de las arterias. En este artículo se describe un protocolo de vídeo sencillo y robusto para teñir los vasos sanguíneos intactos con vascular anticuerpos específicos y anticuerpos fluorescentes secundaria, que es aplicable para vascularizado órganos embrionarios en los que son capaces de seguir el proceso de desarrollo vascular.
Protocolo
1. Ratón recogida de la piel del miembro embrionarias (E13.5 E17.5 ~)
- Eutanasia conectado mujeres mediante el procedimiento de aprobación. De acuerdo con el protocolo aprobado animales, las hembras se sacrifican por el CO 2 de exposición y luego aseguró por dislocación cervical. Coloque el animal en su toalla de papel absorbente y disfrutar a fondo en el 70% de EtOH / H 2 O de un frasco.
- Diseccionar el útero intacto y colocarlo en un 100 x 15 mm placa de Petri que contiene solución salina equilibrada de helado de Hanks (HBSS) para limpiarla de sangre.
- Separados y diseccionar el embrión. Quitar el amnios muy delgada....
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Discusión
El sistema vascular es fundamental para el desarrollo de órganos durante la embriogénesis, así como para el mantenimiento de órganos y funciones de reproducción en los adultos, ya que proporciona suficiente oxígeno y nutrientes a los órganos. Red vascular adecuado es bien establecido, con procesos complejos y múltiples pasos por la angiogénesis en el que se reorganiza pre-existentes de la red capilar con estructuras muy ramificadas y jerárquica. A pesar de numerosos trabajos han demostrado que una variedad de moléculas .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a K. Gill para obtener ayuda con la cría del ratón y el cuidado y la gestión de laboratorio. Gracias también a los miembros Mukoyama laboratorio para ayuda técnica. El financiamiento fue proporcionado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto de Salud Naitonal.
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Materiales
Anticuerpos
Pan-marcador de las células endoteliales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
| PECAM-1 | Hamster Armenia (M) | Chemicon | MAB1398Z | Dilución 1:100 # 1 |
| PECAM-1 | Rata (M) | BD | 553369 | 1:300 dilución |
| VEGFR2 | Rata (M) | eBioscience | 14-5821-82 | Dilución 1:200 |
| CD34 | Rata (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilución |
| Colágeno IV | Conejo (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilución # 2 |
Marcador de células endoteliales arteriales
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| Neuropilin1 | Conejo (P) | El laboratorio de la Kolodkin Alex # 3 | Dilución 1:3000 | |
| Unc5H2 | Cabra (P) | I + D | AF1006 | Dilución 1:200 |
Venosa marcador de células endoteliales
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| EphB4 | Cabra (P) | I + D | AF446 | Dilución 1:100 |
Linfático marcador de células endoteliales
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| LYVE-1 # 4 | Conejo (P) | Abcam | ab14917 | Dilución 1:200 |
| LYVE-1 # 4 | Rata (M) | MBL | D225-3 | Dilución 1:200 |
| Prox-1 | Conejo (P) | Chemicon | AB5475 | Dilución 1:1000 |
| Prox-1 | Cabra (P) | I + D | AF2727 | Dilución 1:50 |
| Neuropilin2 | Conejo (P) | Señalización Celular | 3366 | 1, 100 de dilución |
| Podoplanin | Hámster sirio (M) | Banco hibridoma | 8.1.1 | Dilución 1:200 |
Células del músculo liso / pericitos marcador
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| αSMA-Cy3 | Ratón (M) # 5 | Sigma | c-6198 | Dilución 1:500 # 6 |
| NG2 | Conejo (P) | Chemicon | AB5320 | Dilución 1:200 |
| SM22α | Conejo (P) | Abcam | ab14106 | Dilución 1:200 |
Los anticuerpos para el reportero GFP
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| Las buenas prácticas agrarias | Conejo (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilución |
| Las buenas prácticas agrarias | Rata (M) | Nacalai Tesque | 04404-84 | Dilución 1:1000 |
| Las buenas prácticas agrarias | Pollo (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilución |
Los anticuerpos para el reportero LacZ
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| β-gal | Conejo (P) | MP Biomédica | 55976 | Dilución 1:5000 |
| β-gal | Cabra (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | Dilución 1:500 |
| β-gal | Pollo (P) | Abcam | ab9361 | Dilución 1:200 |
Los anticuerpos de los axones periféricos
| Anticuerpo | Especies | Empresa | Catálogo # | Condiciones de trabajo |
|---|---|---|---|---|
| 2H3 | Ratón (M) # 7 | Banco hibridoma | 2H3 | Dilución 1:200 |
| Tuj1 | Ratón (M) # 8 | Covance | MMS-435P | Dilución 1:500 |
| Periferina | Conejo (P) | Chemicon | AB1530 | Dilución 1:1000 |
Anticuerpos para la migración de las células de Schwann
| BFABP | Conejo (P) | El laboratorio de Thomas Müller es # 9 | Dilución 1:3000 |
|---|
(P): anticuerpo policlonal (M): anticuerpo monoclonal
# 1: de cabra anti-armenio hámster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) de anticuerpos debe ser utilizado como anticuerpo secundario.
# 2: Los anticuerpos colágeno IV puede ser utilizado para detectar los vasos sanguíneos después de la hibridación in situ.
# 3: El anticuerpo es Neuropilin1 amablemente proporcionados por el laboratorio de la Kolodkin de Alex en la Universidad Johns Hopkins. De oveja anti-anticuerpos humanos Neuropilin1 está disponible en I + D (AF3870), aunque no lo he probado todavía.
# 4: Los anticuerpos LYVE-1 también se detecta un subconjunto de los macrófagos en la piel embrionaria.
# 5: El anticuerpo anti-ratón de anticuerpos es αSMA monoclonal IgG2a.
# 6: El anticuerpo conjugado con Cy3 αSMA se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente, junto con el secanticuerpos secundaria de otros anticuerpos primarios.
# 7: 2H3 anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón de anticuerpos contra neurofilamentos.
# 8: Tuj1 anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón de anticuerpos contra las neuronas específicas de la clase III beta-tubulina.
# 9: El BFABP (cerebro-específica de ácidos grasos de unión a proteínas) de anticuerpos es amablemente proporcionados por el laboratorio Thomas Müller en Max-Delbrück-Center de Medicina Molecular.
Referencias
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J.
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Reimpresiones y permisos
