Este artículo detalla el procedimiento de vídeo experimental para la obtención de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas de membrana de triptófano fluorescencia.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia
En este artículo
Resumen
Resumen
Plegamiento de proteínas de membrana es un tema emergente con un significado fundamental y relacionadas con la salud. La abundancia de proteínas de membrana en las células subyace la necesidad de un estudio integral del plegamiento de esta familia de proteínas en todas partes. Además, los avances en nuestra capacidad para caracterizar las enfermedades asociadas con las proteínas mal plegadas, han motivado importantes esfuerzos experimentales y teóricos en el campo de plegamiento de proteínas. Los rápidos avances en este campo tan importante es, por desgracia obstaculizado por los problemas inherentes asociados con las proteínas de membrana y de la complejidad del mecanismo de plegado. Aquí, se describe un procedimiento experimental para la medición de la propiedad termodinámica de la energía libre de Gibbs se desarrolla en ausencia de desnaturalizante, Δ G ° H 2 O, una proteína de membrana integral representante de E. coli. Este protocolo se centra en la aplicación de la espectroscopia de fluorescencia para determinar las poblaciones de equilibrio de los estados plegado y desplegado en función de la concentración de desnaturalizante. Consideraciones experimentales para la preparación de vesículas de lípidos sintéticos, así como pasos clave en el procedimiento de análisis de datos se destacan. Esta técnica es muy versátil y puede llevarse a cabo con diferentes tipos de desnaturalizante, incluyendo la temperatura y pH, así como en diversos entornos de plegado de los lípidos y las micelas. El protocolo actual es el que puede ser generalizado a cualquier membrana o proteínas solubles que se reúne el conjunto de los criterios expuestos.
Protocolo
1. Preparación de ~ 50 nm de diámetro pequeño vesículas unilaminares (SUV) de plegado de proteínas de membrana
- Una solución de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) lípidos en cloroformo se compra y alícuotas en viales de vidrio limpia en cantidades de 20 mg por vial para el almacenamiento. Una capa de gas nitrógeno, se añade a cada vial para evitar la oxidación de lípidos, y los viales están sellados con tapas y parafina. Los viales se almacenan en un congelador a -20 ° C hasta su uso.
- Un solo frasco que contiene una alícuota de 20 mg de lípidos en cloroformo se utiliza para cada experimento. El contenido de la ampolla se seca....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El actual protocolo describe la generación de curvas de desarrollo asociados a la membrana de las proteínas y los péptidos que contienen residuos de triptófano. En este caso, se asume que la fluorescencia de triptófano refleja si la proteína se dobla y se introduce en las vesículas de lípidos sintéticos, o se desarrolló en la solución. Supuestos adicionales, como el plegado de dos estados y la dependencia lineal de energía libre con la concentración de desnaturalizante, se hacen en el presente informe;. Modificación de .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Beijing Wu para el uso de sus datos. Este trabajo fue apoyado por un premio CARRERA NSF a JEK
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urea | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Fosfato de potasio dibásico | Fisher Scientific | P288 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fisher Scientific | P285 |
Referencias
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
