A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

Resumen

Ensayos muerte celular programada de uso común en los sistemas de mamíferos, tales como escalamiento de ADN o los ensayos de TUNEL, a menudo son difíciles de reproducir en las plantas. En combinación con un sistema reportero GUS, se propone una vía rápida, a base de plantas de ensayo transitorio para analizar las propiedades de la muerte potencial de genes específicos.

Resumen

Hemos desarrollado un novedoso sistema de expresión transitoria de plantas que al mismo tiempo expresa el gen reportero β-glucuronidasa (GUS), con la supuesta reguladores positivos o negativos de la muerte celular. En este sistema, N. benthamiana hojas son co-infiltrado con un casete de expresión 35S impulsado que contiene el gen para ser analizados, y el vector GUS pCambia 2301 utilizando LBA4404 cepa de Agrobacterium como un vehículo. Dado que las células vivas son necesarios para la expresión de GUS que se produzca, la pérdida de la actividad GUS se espera que cuando este gen marcador es co-expresada con reguladores positivos de la muerte celular. Igualmente, el aumento de la actividad GUS se observa cuando los genes anti-apoptóticos se utilizan en comparación con el control de vectores. Como se muestra a continuación, hemos utilizado con éxito este sistema en nuestro laboratorio para analizar los dos jugadores a favor y en contra la muerte. Estos incluyen la planta de anti-apoptótica Bcl-2 asociada athanoGene (BAG) de la familia, así como, los mamíferos conocidos inductores de la muerte celular, tales como BAX. Además, hemos utilizado este sistema para analizar la función de la muerte de truncamientos específicos dentro de las proteínas, lo cual podría proporcionar pistas sobre la posible modificación post-traduccional / activación de estas proteínas. A continuación, presentamos un método rápido y sensible de plantas basado, como un paso inicial en la investigación de la función de la muerte de genes específicos.

Protocolo

Plantas de Nicotiana benthamiana se cultivan en una cámara de crecimiento con temperatura controlada a 25 ° C. Totalmente expandido hojas sanas de plantas de 3-6 semanas de edad se utilizan.

Consejo: Se obtienen mejores resultados mediante el uso de hojas de reciente aparición

1. Agrobacterium protocolo de infiltración transitoria:

Día 1

1. LB racha / rifampicina (25 mg / ml) / kanamicina (100 mg / ml) placas de agar con las acciones de glicerol de Agrobacterium tumefaciens (cepa LBA4404) que contiene los vectores apropiados con el gen de la (s) a ensayar para la muer....

Discusión

A menudo es difícil de usar las técnicas de detección de células de muerte en las plantas que son comunes en sistemas de mamíferos. En combinación con un sistema reportero GUS, se presenta un método a base de plantas, sensibles para la detección y análisis de los jugadores de la muerte celular. Este método aprovecha el simple hecho de que las células vivas son necesarios para la expresión de GUS a ocurrir. Para asegurar resultados significativos y repetibilidad, es fundamental que las culturas que alberga la cinta GU.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Rifampicina	VWR	IC19549001	25mg/mL en DMSO
4'-hidroxi-3 ', 5'-dimethoxyacetophenone (acetosiringona)	VWR	TCD2666	0,981 g / ml en DMSO (1M stock)
2 - (4-morfolino) etanosulfónico monohidrato de ácido (MES)	VWR	EM-6110	1,92 g / L en el agua para hacer 1 litro de los medios de infiltración
Bacto-triptona	Pescador	BP1421-2	10 g / L en el agua para hacer una L de medio LB
Bacto-extracto de levadura	VWR	EM1.03753.0500	5 g / L en el agua para hacer una L de medio LB
Cloruro de sodio	VWR	EM-7710	10 g / L en el agua para hacer una L de medio LB
Fosfato de sodio monobásico monohidrato	VWR	MK-7868 a 12	2,5 g / L en el agua para la toma de 50 mM de tampón NaPi
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado	VWR	EMD-SX0715-1	5 g / L en el agua para la toma de 50 mM de tampón NaPi
Magnesio heptahidrato de sulfato	VWR	EM-MX0070-1	2,5 g / L en el agua para hacer 1 litro de los medios de infiltración
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	0,1% v / v en buffer GUS
5-bromo-4-cloro-3-indoxyl-beta-D-glucurónido cyclohexylammonium sal (X-gluc)	Oro Biotecnología	G1281C	1mg/100uL en metanol 100%
4-metilumbeliferil-μ-D-glucurónido hidrato (MUG)	Sigma	M5664	2 mM en 100 uL de tampón de extracción GUS
Trihidrato de ferrocianuro potásico	VWR	EM-PX1460-1	De valores de 100 mm para la solución de sustrato X-gluc
β-metilumbeliferona (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	Por MU tampón estándar utilizar la curva de extracción de GUS
De carbonato de sodio	VWR	EM-SX0395-11	0,2 M en agua para la toma de GUS tampón de detención