Un método rápido para obtener la infiltración de leucocitos en el cerebro murino se describe. Este método utiliza un gradiente de Percoll continua y discontinua gradiente de Ficoll para seleccionar y purificar la capa de leucocitos enriquecido. Leucocitos aislados se puede caracterizar por las mediciones de citometría de flujo.
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Artículo de método
El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-
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Resumen
Resumen
Se describe un método para la preparación de los leucocitos cerebro infiltrante (BILS) de los ratones. Demostramos cómo infectar a los ratones con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) a través de una técnica de inyección rápida intracraneal y la manera de purificar a la población de leucocitos enriquecido de infiltración de las células de todo el cerebro. En pocas palabras, los ratones son anestesiados con isoflurano en una cámara cerrada y son a mano alzada inyecta con una jeringa Hamilton en la corteza frontal. Los ratones son sometidas a muerte en varias ocasiones después de la infección por sobredosis de isoflurano y el cerebro entero se extraen y se homogeneizaron en RPMI con un triturador de tejidos Tenbroeck. Cerebro homogeneizado se centrifuga a través de un gradiente de Percoll continua del 30% para eliminar los restos celulares de mielina y otros. La suspensión celular Luego, se cuela a 40 micras, lavado y centrifugado en forma discontinua Ficoll-Paque Plus gradiente para seleccionar y purificar los leucocitos. Los leucocitos se lavan y se volvieron a suspender en los tampones apropiados para determinar el inmunofenotipo por citometría de flujo. La citometría de flujo revela una población de células del sistema inmune innato en las primeras etapas de la infección en ratones C57BL / 6. A las 24 horas post-infección, varios subconjuntos de células inmunes están presentes en el BILS, con una población enriquecida de Gr1 +, CD11b + y F4/80 + células. Por lo tanto, este método es útil en la caracterización de la respuesta inmunitaria a una infección aguda en el cerebro.
Protocolo
1. Inyección de virus intracraneal:
La siguiente técnica ha sido modificada y utilizada ampliamente por nuestro laboratorio y sus colegas. En pocas palabras, la inyección intracraneana de la cepa de virus de Daniel murina de Theiler encefalomielitis (TMEV) o simulada-infección (1, 10) se lleva a cabo en ratones jóvenes (preferiblemente 5-6 semanas de edad) para obtener los leucocitos cerebro infiltrante (BILS). Tenga en cuenta que los resultados difieren entre la cepa de Daniel, la cepa Bean, y la cepa GDVII. Con el fin de la cosecha BILS, ratones reciben 2x10 5 PFU de TMEV y se infectan durante 24 horas.
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Discusión
Nosotros usamos la citometría de flujo para determinar la calidad de la preparación de la infiltración de las células cerebrales, y para distinguir las diferentes poblaciones de células inmunes 2, 9. En agudo puntos de tiempo, nuestro método BILS rendimientos altos porcentajes de monocitos inflamatoria dentro de la población CD45hi, así como un alto porcentaje de los macrófagos en la población CD45lo. Esto indica que una respuesta inmune reproducibles dentro del cerebro con firmeza se puede caracterizar por n.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la beca NS64571 del NINDS (CLH), por un premio de desarrollo de carrera a principios de la Clínica Mayo (CLH), y por un generoso regalo de Donald y Frances Herdrich (CLH). Nos gustaría agradecer a la Clínica Mayo de flujo básico Citometría de asistencia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| TMEV | Howe laboratorio | N / A | |
| Cepa de Daniel | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurano | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| de fondo redondo de roble tubos de centrífuga de canto | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| PBS 10 veces | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Azul de tripano al 0,4% (w / v) | Mediatech | 25 a 900-CI | |
| 15 ml tubos cónicos | BD Falcon | 352097 | |
| 7 ml de vidrio Pyrex marca Tenbroeck triturador de tejidos | Pescador | 08 a 414-10B | |
| 40 m de células colador | BD Falcon | 352340 | |
| Cónico de 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| albúmina de suero bovino | Sigma | A9647 | |
| azida de sodio | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21 a 040 CV | |
| FACS tubos | BD Falcon | 352054 | |
| de suero fetal bovino | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hibridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-fondo de la placa | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrífuga o equivalente | Beckman | N / A | |
| De 96 pozos balde plato y rotor | Beckman | S2096 | |
| Rotor de ángulo fijo | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N / A | |
| FlowJo 7.5 | Árbol Star, Inc. | N / A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clon: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C / G) | BD Biosciences | 553128 | clon: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clon: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clon: BM8 |
Referencias
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
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Reimpresiones y permisos
