Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.
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Artículo de método
Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las espinas dendríticas son los sitios de la mayoría de las conexiones excitatorias en el cerebro, y forman el compartimiento de post-sináptica de las sinapsis. Estas estructuras son ricas en actina y han demostrado ser altamente dinámico. En respuesta a la plasticidad clásica Hebb así como señales de neuromoduladores, las espinas dendríticas pueden cambiar de forma y número, que se cree que es fundamental para el perfeccionamiento de los circuitos neuronales y la transformación y el almacenamiento de información dentro del cerebro. Dentro de las espinas dendríticas, una compleja red de proteínas de enlace de señales extracelulares con la cyctoskeleton actina que permite el control de la morfología de la espina dendrítica y el número. Estudios neuropatológicos han demostrado que un número de estados de enfermedad, que van desde la esquizofrenia hasta trastornos del espectro autista, mostrar la morfología anormal de la espina dendrítica o números. Por otra parte, recientes estudios genéticos han identificado mutaciones en muchos genes que codifican las proteínas sinápticas, lo que lleva a sugerir que estas proteínas pueden contribuir a la plasticidad de la columna vertebral aberrante que, en parte, la base de la fisiopatología de estos trastornos. Con el fin de estudiar el papel potencial de estas proteínas en el control de las morfologías dendríticas columna / número, el uso de cultivos de neuronas corticales ofrece varias ventajas. En primer lugar, este sistema permite obtener imágenes de alta resolución de las espinas dendríticas en las células fijadas, así como time-lapse de imágenes de células vivas. En segundo lugar, este sistema in vitro permite una fácil manipulación de la función de proteínas mediante la expresión de las proteínas mutantes, caída por las construcciones shRNA, o tratamientos farmacológicos. Estas técnicas permiten a los investigadores comienzan a analizar el papel de las enfermedades asociadas a proteínas y para predecir cómo las mutaciones de estas proteínas pueden funcionar in vivo.
Protocolo
El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para examinar la morfología de la espina dendrítica y la dinámica de cualquier sistema de cultivo primario.
1. La preparación de cultivos primarios de neuronas corticales
- Prepare de alta densidad cultivos de neuronas corticales de rata Sprague-Dawley E18 embriones y la cultura en la glía acondicionado medio libre de suero 1-2.
- La eutanasia a una rata preñada (E18), de acuerdo a los procedimientos de ACUC, rápido extraer el útero (con fetos en el mismo) y colocar en una placa de Petri de 100 mm sobre el hielo.
- Cortar el útero abierto y de membrana amni....
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Discusión
Las técnicas descritas anteriormente para el análisis cuantitativo detallado de la morfología de la espina dendrítica, densidad lineal y la movilidad en fijos o en vivo las neuronas corticales primaria se centran en la comprensión de los efectos de la post-sináptica mecanismos que pueden contribuir a neuropatologías. Un enfoque similar puede utilizarse para cuantificar la morfología de la columna vertebral o de la motilidad en cualquier neurona espinosa, incluyendo piramidales del hipocampo, Purkinje, o neuronas espinos.......
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Divulgaciones
La producción de este trabajo fue apoyado por MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).
Agradecimientos
Damos las gracias a Kelly Jones para la edición de cuidado. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01MH 071316, la Asociación de Alzheimer, la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD), y la Alianza Nacional para la Investigación del Autismo (NAAR) (PP), la American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de América Becas predoctorales Heart Association (KMW).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| 18 mm redonda cubierta de vidrio N º 1.5 | Warner Instrumentos | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm cuadrados cubierta de vidrio N º 1.5 | Warner Instrumentos | 64 hasta 0721 (CS-22S15) | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P-0899 | 70 MW ~ 150 kDa |
| Los medios de comunicación Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamina | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140148 | |
| D, L-APV (AP-5) | Ascenso Científico | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | Mediatech Cellgro | 25-060 C-1 | 1 M, pH 7 |
| Solución de formaldehído | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, grado histológico |
| Las cabras de suero normal | VWR | 100188-514 | Jackson ImmunoResearch Labs. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros orgánicos |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H + L) muy transversal adsorbido | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H + L) * muy transversal adsorbido * | Invitrogen | A-11034 | |
| Prolongar reactivo Antifade Oro | Invitrogen | P36934 | Embalaje especial |
| Imágenes de cámara cerrada la etapa | Warner | RC-30 HV | |
| Unidad de control de temperatura | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
Referencias
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L.
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Reimpresiones y permisos
