Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.
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Artículo de método
Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal
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En este artículo
Resumen
Resumen
Axones en el sistema nervioso central (SNC) no se regeneran mientras que en el sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran de forma limitada después de la lesión (Teng et al., 2006). Se reconoce que los programas de transcripción esencial para crecimiento de las neuritas y axones se reactivan después de la lesión en el SNP (Makwana et al., 2005). Sin embargo las herramientas disponibles para analizar la regulación de genes neuronales in vivo son limitadas y desafíos.
Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) ofrecen un sistema modelo excelente lesiones ya que tanto el SNC y SNP son inervadas por un axón bifurcado procedentes de la soma mismo. Los ganglios representan una colección discreta de cuerpos celulares en todos los eventos de la transcripción se producen, y proporcionar así una región claramente definida de la actividad transcripcional que puede ser fácilmente reproducible y retirado del animal. Lesiones de las fibras nerviosas en el SNP (nervio ciático, por ejemplo), donde la regeneración axonal ocurre, debe revelar una serie de programas de transcripción que son distintos de los que respondieron a una lesión similar en el sistema nervioso central, donde la regeneración no tiene lugar (por ejemplo, la médula espinal ). Sitios de unión factor de transcripción, histonas y la modificación del ADN resultante de una lesión a cualquiera SNP o sistema nervioso central puede caracterizarse utilizando inmunoprecipitación de cromatina (CHIP).
Aquí se describe un protocolo de chip usando tejido fijado DRG ratón después de una lesión axonal. Esta poderosa combinación ofrece un medio para caracterizar el entorno de la cromatina a favor de la regeneración necesaria para promover la regeneración axonal.
Protocolo
1. Columna dorsal ciático y la lesión del nervio
- El animal se coloca sobre un paño quirúrgico y por debajo de ella un thermopad está presente durante todo el procedimiento, manteniendo la temperatura corporal del ratón a 37 ° C. Todos los animales son anestesiados para una cirugía con una continua isoflurano / O 2 de la administración. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes del procedimiento.
- Por lesiones ciático, ambos miembros posteriores son cuidadosamente afeitado y la depilación se ha completado con el removedor de pelo genéricos antes de la limpieza de la piel con alcohol seguido por Betadyne 3 veces.
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Discusión
Este protocolo proporciona un método de preguntar directamente sobre el medio ambiente de la cromatina durante la regeneración axonal en el sistema nervioso adulto después de una lesión axonal. Se incorpora el modelo de lesión DRG con inmunoprecipitación de cromatina para investigar el entorno de la transcripción y epigenéticos posteriores a la lesión a cualquiera de los SNP o sistema nervioso central. Es particularmente útil para los investigadores que deseen para caracterizar putativo sitios de unión para el factor de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Andrea Tedeschi para ayudar en el establecimiento de los experimentos inicial de fichas en el laboratorio y Lindner Ricco por su contribución a ajustar las condiciones para el chip. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Hertie, la subvención de Fortune, de la Universidad de Tubinga, y la DFG DI subvenciones 1497/1-1 (todos los concedidos a Simone Di Giovanni).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Buffer chip 10 veces | Señalización Celular | 7008 | |
| Chip 2x Tampón de Elución | Señalización Celular | 7009 | |
| Grado chip de proteína G bolas magnéticas | Señalización Celular | 9006 | |
| Bastidor de agarre Magna (8 también) | Millipore | 20-400 | |
| Cloroformo | MERCK | De las Naciones Unidas 1888 | |
| 37% de formaldehído | ROTH | CP10.1 | |
| 10x solución de glicina | Señalización Celular | 7005 | |
| Glucógeno | Sigma | G1767 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185 | |
| Histona H3 de anticuerpos (conejo) | Señalización Celular | 2650 | |
| IgG normal de conejo | Señalización Celular | 2729 | |
| Fenol / cloroformo / alcohol isoamílico | ROTH | A156.1 | |
| Inhibidores de la proteasa Cocktail comprimidos | Roche | 04 693 116 001 | |
| Proteinasa K (20 mg / ml) | Señalización Celular | 10012 | |
| Tampón de lisis SDS | Al norte del estado | 20-163 |
| Equipo necesario |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrífuga |
| Thermomixer |
Referencias
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Har....
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Reimpresiones y permisos
