Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Summary

El estudio describe un método costo-efectivo para la identificación de la fuente de contaminación fecal / orina o la contaminación por nitratos en el agua utilizando qPCR para la cuantificación específica de los virus de ADN humano / porcino / bovino, adenovirus y poliomavirus, propuesto como herramientas de MST.

Abstract

La contaminación microbiana del medio ambiente representa un riesgo significativo para la salud. Clásicos indicadores fecales bacterianos han demostrado que tienen limitaciones significativas, los virus son más resistentes a procesos de inactivación y muchos indicadores estándar fecal no informan sobre la fuente de contaminación. El desarrollo de métodos eficientes para la concentración de virus a partir de agua y ensayos moleculares facilita la aplicación de los virus como indicadores de contaminación fecal y herramientas de software como el seguimiento microbiano (MST). Adenovirus y poliomavirus son virus ADN infectar a especies específicas de vertebrados incluyendo a los humanos y son persistentemente excreta en las heces y / o de orina en todas las áreas geográficas estudiadas. En estudios anteriores, hemos sugerido la cuantificación de los adenovirus humanos (HAdV) y poliomavirus JC (JCPyV) por PCR cuantitativa (qPCR) como un índice de contaminación fecal humana. Recientemente, se han desarrollado ensayos de PCR cuantitativa para la cuantificación específica del porcine adenovirus (PADV) y poliomavirus bovina (BPYV) como animales marcadores de contaminación fecal con la sensibilidad de copias del genoma 1.10 por tubo de ensayo. En este estudio, se presenta el procedimiento a seguir para identificar la fuente de contaminación en muestras de agua usando estas herramientas. Como ejemplo de resultados representativos, el análisis de virus en el agua subterránea presenta altos niveles de nitratos se muestra.

Detección de virus en las aguas contaminadas de baja o moderada requiere la concentración de los virus por lo menos de varios litros de agua en un volumen mucho menor, un procedimiento que generalmente consta de dos etapas de concentración en serie. Este procedimiento un tanto engorroso y la variabilidad observada en la recuperación viral significativamente interferir con el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras de agua.

Con el fin de eliminar los cuellos de botella causados ​​por los procedimientos de dos pasos que hemos aplicado un protocolo de un solo paso desarrollado en Studie anteriors, y aplicable a una diversidad de matrices de agua. El procedimiento incluye: la acidificación de las muestras de agua de diez litros, floculación de la leche desnatada en polvo, sedimentación por gravedad de los materiales floculada, la recogida del precipitado y centrifugación, resuspensión del precipitado en tampón fosfato 10 ml. El concentrado viral se utiliza para la extracción de ácidos nucleicos virales y los adenovirus y poliomavirus específicos de interés se han cuantificado mediante qPCR. Alto número de muestras se podrá analizar simultáneamente con este método de concentración de bajo costo.

El procedimiento se ha aplicado al análisis de las aguas de baño, agua de mar y agua de los ríos y en este estudio, se presentan los resultados de analizar muestras de agua subterránea. Este método cuantitativo de alto rendimiento es fiable, sencilla y rentable.

Protocol

1. Concentración de las partículas virales presentes en muestras de agua

1. Recolección y acondicionamiento de muestras de agua
   1. Recoger un mínimo de dos réplicas de 10 L por cada muestra en recipientes de plástico con fondo plano y una muestra adicional, como el control del proceso. Esta última muestra se enriquece con una cantidad conocida de partículas virales y se utiliza como control.
      Nota: Se recomienda contar con un material especial independiente (botellas, tubos, etc) para muestras adicionadas.
   2. Verificar la calibración del conductímetro y volver a calibrar si es necesario. Preparar un control negativo con agua del grifo previam....

Discussion

El procedimiento descrito se cumplen las condiciones para un método de ajuste de rutina de los laboratorios de salud ambiental y pública: reproducible, fiable, sencillo y rentable. El protocolo es sencillo, sin embargo, deben seguirse estrictamente. Baja conductividad en las muestras sin necesidad de añadir la concentración de sales pidió agua de mar artificial reduciría dramáticamente la recuperación de los virus, como sería el caso si el tiempo de agitación para la floculación es significativamente reducida (men.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga de alta velocidad (8.000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH-metro, termómetro y conductímetro	Afora	LPPC3003
Tubos de plástico 100-200 cm de longitud	Deltalab	350059
Se graduó pipetas desechables estériles	Labclinics	PN10E1
Tubos estériles de plástico de 1,5 y 10-15 ml (Eppendorf, halcones, etc)	Afora	KA298/00
Ollas centrifugadora (500 mL)	Fisher Scientific	SE5753512
Agitadores magnéticos e imanes (uno porde la muestra)	Fisher Scientific	10510
De vidrio o recipientes de plástico con fondo plano para permitir el uso de agitadores magnéticos	Deltalab	191642
Una bomba peristáltica para retirar el sobrenadante (o una bomba de vacío por chorro de agua)	Watson-Marlow	323E / D
Temporizador para apagar la agitación después de 8-10 horas	Deltalab	900400
El ácido clorhídrico (1 N y 0,1 N)	Panreac	141020.1611
Hidróxido de sodio (1N)	Panreac	131687.1211
Sales del agua de mar artificial mar	Sigma	S9883
La leche desnatada (SM)	Difco	232100
Fosfato de pH 7, 5			1:2 v / v de estériles Na 2 HPO 4 0,2 M y NaH 2 PO 4 0,2 M a pH 7,5
Tiosulfato	Panreac	121879.1209	Prepare una solución de 10% en agua
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
De 96 pocillos placa de reacción óptica (500 unidades)	Applied Biosystems	43426659
Óptica cubre adhesivo (100 unidades)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan PCR Master Mix Ambiental 2x	Applied Biosystems	4396838