La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser dirigida de las células de la nefrona renal en el riñón del embrión de pez cebra, o pronefros. Nuestro nuevo método puede ser utilizado para complementar la nefrotoxicidad inducida por los modelos de IRA y obtener un conocimiento de alta resolución de la célula y las alteraciones moleculares que están asociados con la regeneración del epitelio de la nefrona renal.
Artículo de método
La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La lesión renal aguda (IRA) se caracteriza por altas tasas de mortalidad de deterioro de la función renal durante un período de horas o días que culmina en insuficiencia renal 1. AKI puede ser causada por una serie de factores, incluyendo la isquemia, las drogas basadas en la toxicidad o lesiones obstructivas 1. Esto se traduce en una incapacidad para mantener la homeostasis de fluidos y electrolitos. Mientras AKI se ha observado durante décadas, a partir terapias clínicas aún no se han desarrollado. Curiosamente, algunos pacientes con lesión renal aguda recuperar la función renal con el tiempo, un fenómeno misterioso que sólo se ha caracterizado rudimentally 1,2. La investigación que utiliza modelos de mamíferos de la IRA ha demostrado que los riñones isquémicos o nefrotoxina heridos-experiencia de la muerte de las células epiteliales de los túbulos nefrona 1,2, las unidades funcionales del riñón que se componen de una serie de áreas especializadas (segmentos) de tres tipos de células epiteliales . Dentro de las nefronas, la muerte de las células epiteliales es mayor en las células del túbulo proximal. Hay evidencia que sugiere que la destrucción celular es seguido por desdiferenciación, proliferación y migración de las células epiteliales circundantes, que pueden regenerar completamente la nefrona 1,2. Sin embargo, hay muchas preguntas sin respuesta acerca de los mecanismos de la regeneración del epitelio renal, que van desde las señales que modulan estos eventos a los motivos de la amplia variedad de habilidades entre los seres humanos para regenerar riñones lesionados.
La larvas de pez cebra ofrece un excelente modelo para estudiar la regeneración del epitelio renal como su riñón pronephric se compone de nefronas que se conservan en los vertebrados superiores, incluyendo mamíferos 4,5. Las nefronas de las larvas de pez cebra se pueden visualizar con técnicas de fluorescencia debido a la relativa transparencia de los jóvenes pez cebra 6. Esto proporciona una oportunidad única de celda de la imagen y los cambios moleculares en tiempo real, en contraste con los modelos de mamíferos, donde nefronas son inaccesibles porque los riñones son sistemas estructuralmente complejos interiorizarse dentro del animal. Estudios recientes han utilizado la gentamicina aminoglucósidos como un agente tóxico causante de estudio de la lesión renal aguda e insuficiencia renal posterior: la gentamicina y otros antibióticos se ha demostrado que causan IRA en los seres humanos, y los investigadores han formulado métodos para utilizar este agente para provocar daño a los riñones en el pez cebra 7 , 8. Sin embargo, los efectos de la toxicidad de los aminoglucósidos en las larvas de pez cebra son catastróficos y mortales, que presenta una dificultad en el estudio de la regeneración epitelial y función en el tiempo. Nuestro método se presenta el uso de la ablación de células específicas como una nueva herramienta para el estudio de la lesión epitelial en el pez cebra. La ablación con láser ofrece a los investigadores la capacidad de inducir la muerte celular en una población limitada de las células. Otros campos de las células pueden ser escogidos en base a la ubicación morfológica, la función, o incluso la expresión de un fenotipo celular particular. Por lo tanto, la ablación por láser aumentar la especificidad de lo que los investigadores pueden estudiar, y puede ser un enfoque nuevo y poderoso para arrojar luz sobre los mecanismos de regeneración del epitelio renal. Este protocolo se puede aplicar ampliamente a llegar a las poblaciones de células en otros órganos en el embrión de pez cebra para el estudio y la regeneración de lesiones en cualquier número de contextos de interés.
Protocolo
1. Procedimiento de microinyección para marcar el epitelio del túbulo proximal del pronefros de pez cebra
Para este procedimiento, utilizamos un sistema de microinyección (Harvard Appartus, PLI90), con aire presurizado suministrado por un compresor de aire (Jun-Air, Modelo 6-4), y un aparato micromanipulador (piezas Narishege MN151, IP3 y GJI) que se ensamblan en una estación de microscopio estereoscópico (Nikon, SMZ-Zoom 645) según las instrucciones del fabricante. Los conjugados de dextrano son fácilmente endocitados por el túbulo proximal del nefrón, lo que permite la marcación preferencial de esta población de células epiteliales9.
- La exposición al azul de metileno puede acentuar la autofluorescencia del saco vitelino y dificultar la visualización de los túbulos nefrónicos.
- Criar los embriones fertilizados a 28,5 °C hasta un punto temporal de desarrollo entre 48 y 55 horas post-fertilización (hpf). Esta es la etapa ideal para realizar microinyecciones en larvas debido a la facilidad con la que puede realizarse la microinyección intramuscular, y porque en este momento comienza la función renal.
- Eliminar la coriona de cualquier pez cebra no eclosionado utilizando un par de pinzas finas. Enjuagar los restos de coriona del plato de Petri y rellenar nuevamente el plato con 30 mL de solución E3 modificada.
- Preparar una bandeja de inyección para los embriones. Nuestro molde de inyección preferido está hecho de agarosa al 1,5 % en E3, en el que se forman depresiones triangulares para que el embrión pueda colocarse dentro para la inyección. Para fabricar el molde de inyección, colocamos flotando un molde de plástico con protrusiones en forma de cuña (descrito con detalle anteriormente11) en un plato de Petri lleno con una base de agarosa al 1,5 %.
- Preparar agujas de microinyección de vidrio estirando tubos capilares con un estirador de agujas, como se describe en el Zebrafish Book10. En resumen, estirar los tubos capilares de vidrio y luego usar pinzas metálicas finas para cortar la punta de la aguja de microinyección y obtener una punta afilada, observando la punta bajo un estereomicroscopio. Almacenar las agujas cortadas cubiertas en un plato de Petri y colocadas sobre arcilla modelable para proteger el borde cortado y evitar la acumulación de polvo.
- Preparar la solución de inyección para marcar el túbulo proximal. Disolver el conjugado de dextrano-fluoresceína de 40 kD (Invitrogen, D1845) a una concentración de 1 mg/mL en agua destilada.
- Para anestesiar los peces, añadir 5 mL de Tricaina al 0,2 % a pH 7,0 al plato de Petri que contiene las larvas de pez cebra en 30 mL de E3. Los peces quedan anestesiados cuando ya no presentan respuesta al tacto. Es fundamental que los peces estén completamente anestesiados, ya que de lo contrario se moverán al intentar inyectarlos.
- Transferir los peces anestesiados a la bandeja del molde de inyección utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Colocar al animal con la cabeza en la parte más profunda del pozo en forma triangular, y de lado, de modo que el tronco descanse a lo largo del lado inclinado del pozo.
- Realizar la microinyección intramuscular. Cargar una aguja cortada con 2-3 μL de dextrano-fluoresceína e inyectar al animal en un somita del tronco con aproximadamente 1 nL de solución. Apuntar a la porción superior del somita y evitar la extensión del saco vitelino. Esto asegura que los túbulos nefrónicos no se alteren mecánicamente durante el proceso de microinyección.
- Transferir los peces cebra inyectados a un plato de Petri limpio y añadir solución E3 modificada. Enjuagar los animales tres veces con E3 fresca para eliminar cualquier rastro de Tricaina. Cubrir la tapa del plato de Petri con papel de aluminio para proteger al dextrano de la luz y devolver los animales al incubador a 28 °C durante la noche.
2. Ablación láser dirigida de células del túbulo proximal
Para este procedimiento, utilizamos un estereomicroscopio con epifluorescencia para identificar animales cuyos túbulos proximales estén marcados intensamente con dextrano marcado con fluoresceína y seleccionarlos para la ablación láser. Luego, empleamos un sistema láser pulsado Micropoint (Photonic Instruments, Inc) acoplado a un microscopio compuesto (Nikon Eclipse 80i con accesorio de epifluorescencia), calibrado según las instrucciones del fabricante, para realizar la ablación de células del nefrón. Hemos obtenido los mejores resultados en la ablación celular utilizando un filtro FITC que permite al investigador visualizar las regiones de los túbulos fluorescentes bajo iluminación de campo claro.
Antes de este procedimiento, prepare el medio de inmovilización para la ablación disolviendo metilcelulosa al 1,5 % en tricaina al 0,02 % en E3. Almacene alícuotas de metilcelulosa para su uso inmediato a temperatura ambiente, o a 4 °C para almacenamiento a largo plazo.
- Anestesiar los peces cebra de 72 hpf añadiendo 5 mL de Tricaina al 0,2 %, pH 7,0, a la placa de Petri que contiene las larvas de pez cebra en 30 mL de medio E3. Los peces estarán anestesiados cuando ya no presenten respuesta al tacto. Es fundamental que los peces estén completamente anestesiados, ya que de lo contrario se moverán bruscamente al intentar realizar la ablación láser.
- Examine los animales inyectados bajo el ajuste fluorescente adecuado y seleccione aquellos animales en los que pueda visualizar fácilmente los túbulos proximales.
- Transfiera los embriones seleccionados a un plato separado que contenga tricaina. Los animales pueden ser anestesiados hasta por 30 minutos antes de realizar la ablación celular. Si usted puntúa >15 animales, devuélvalos a un plato separado que contenga E3 modificado fresco mientras esperan la ablación, ya que cada ablación celular lleva varios minutos.
- Para realizar la ablación, transfiera un pez cebra anestesiado a una pequeña placa de Petri que contenga metilcelulosa al 1,5 % / tricaina al 0,02 % durante 2 minutos para lavar el embrión en el medio de inmovilización.
- A continuación, transfiera el embrión a una placa de vidrio con cavidad que contenga una gota de metilcelulosa al 1,5 %/tricaina al 0,02 %. Posicione suavemente el animal con una sonda fina de modo que su lado ventral quede enfrentado hacia la placa y el lado dorsal quede hacia arriba.
- Coloque el portaobjetos sobre la platina del microscopio compuesto y enfoque el lado dorsal del animal. Realice la ablación de las células del nefrón bajo enfoque presionando el pedal de pie. Observará la dispersión de la fluorescencia a medida que las células epiteliales renales sean ablacionadas (Figura 1A).
- Transfiera suavemente el animal ablacionado a un pocillo de una placa de 12 pocillos para su posterior cultivo. Lave el medio E3 de 2 a 3 veces para eliminar la metilcelulosa.
- Después de la inyección, eleve el animal hasta el punto temporal deseado y realice el análisis deseado según las técnicas histológicas y moleculares establecidas para embriones jóvenes de pez cebra (Figura 2).
3. Resultados representativos:
Los datos que se muestran en la Figura 1 indican el curso temporal de la ablación. Después de la inyección intramuscular con conjugados de dextrano, se marca preferentemente el túbulo proximal. Se utilizó la inyección de dextrano-FITC para marcar el riñón antes de la ablación láser, y los animales ablacionados se volvieron a inyectar con dextrano-rodamina en un punto temporal adicional tras la ablación, con el fin de volver a obtener imágenes de la población del túbulo proximal. Técnicas de análisis de expresión como la hibridación in situ pueden emplearse para analizar cambios en muestras fijadas en puntos temporales individuales tras la ablación celular, tal como se muestra en la Figura 2.
Figura 1: El procedimiento de ablación láser es seguido por una rápida regeneración del epitelio del túbulo. (A-C) Curso temporal de los cambios celulares durante y posteriores a la ablación láser de los túbulos proximales de larvas de pez cebra en el momento de la ablación (día 3, panel A), o uno o tres días después de la ablación (día 4, panel B; día 7, panel C). (Arriba) esquemas muestran la posición del nefrón, con dextrano-FITC (verde) y dextrano-rodamina (rojo), y (abajo) imágenes en vivo de nefrones control y nefrones ablacionados con láser (LA).
Figura 2: Análisis de la expresión génica tras la ablación con láser. Tras la ablación con láser en el día 3, los embriones se fijaron y procesaron mediante hibridación in situ en montaje completo para detectar los transcritos de slc20a1a, que marcan el segmento del túbulo contorneado proximal del nefrón. (A) Un embrión control que no fue sometido a ablación con láser, (B) un embrión en el que se ablató un extenso tramo del epitelio tubular, y (C) un embrión en el que se ablató un breve segmento del epitelio tubular. La línea negra indica la extensión del túbulo proximal en A para proporcionar una referencia, las líneas azules indican la extensión de la ablación con láser en los paneles B-C, y el asterisco (*) indica el nefrón contralateral control (no ablatado) en los paneles B-C.
Discusión
El pez cebra es un organismo modelo ampliamente utilizado en muchos aspectos de la ciencia, las aplicaciones de las que están creciendo 6. El empleo del sistema de modelo de pez cebra en el estudio de enfermedades renales como la IRA ha llevado a importantes observaciones y seguirá siendo un buen modelo para estudiar la lesión renal 7,8. Con un genoma que se ha secuenciado y muchos protocolos moleculares en su lugar, se ha convertido cada vez más fácil para llevar a cabo la investigación que utiliza pez cebra sofisticados modelos transgénicos, derribo y estudios de genética misexpression. El pez cebra tiene un ciclo vital corto con un tamaño de la generación de grandes y bien definidas las etapas de desarrollo. Además, las etapas de embriones y larvas de pez cebra son en gran medida transparente, por lo que los estudios de imagen posible sin la disección del organismo. A lo largo de las etapas embrionarias y larvas, el pez cebra tiene un riñón pronephric compone de dos nefronas, que siguen siendo visibles en estos puntos de tiempo de desarrollo. Pez cebra nefronas pronephric son análogos en estructura y función a sus homólogos de los mamíferos, por lo que es un buen modelo para estudios de toxicidad aguda insuficiencia renal 4,5.
El riñón es crucial para la supervivencia de los seres humanos y otros vertebrados, que actúa como el órgano que limpia el cuerpo de los desechos metabólicos líquido. Esta función de limpieza se basa en la capacidad de las nefronas del riñón para filtrar la sangre, y luego modificar el filtrado para recoger los desechos nitrogenados en la secreción y al mismo tiempo mantener el equilibrio de líquidos y electrolitos. Nefronas se componen de un filtro de la sangre, los túbulos epiteliales, y la fuga en un conducto. La integridad estructural y funcional de las tres partes es esencial para la función de nefronas. Diversos insultos a los riñones, incluyendo la exposición a nefrotoxinas, la isquemia, o la obstrucción del tracto de salida urinaria puede dar lugar a un IRA. La patología de la lesión renal aguda se asocia a menudo con 1,2 necrosis tubular aguda. Los estudios clínicos han demostrado que el consiguiente insuficiencia renal tiene una mortalidad que puede oscilar entre 7-80% dependiendo de la causa y el contexto de la insuficiencia renal. Sin embargo, el diagnóstico rápido y la inversión de la causa subyacente de la IRA es cada vez más asociado con la recuperación a través de la regeneración de los túbulos nefrona necrótico. Recientes estudios de mapeo destino han demostrado que la población de células grandes que vuelve a llenar dañado túbulos nefrona son las células epiteliales que se originan en las áreas adyacentes, sin lesiones 12. Estos hallazgos no han eliminado la posibilidad de que renal células madre / progenitoras pueden participar en el proceso, y los informes independientes han sugerido que las células derivadas de médula ósea pueden contribuir a la regeneración renal 13. Está claro que continuaban las investigaciones son necesarias para resolver mejor las fuentes celulares de la regeneración del epitelio renal.
Tanto la regeneración y el desarrollo de nefronas comparten el fenómeno de los interruptores en el estado entre los fenotipos celulares mesenquimales y epiteliales. Durante el desarrollo de nefronas, las células mesenquimales precursoras se diferencian en un fenotipo fijas, correspondientes a una membrana basal para formar el epitelio tubular 3. El fenómeno migratorio especulado de las células epiteliales después de la insuficiencia renal aguda requiere una desdiferenciación en un fenotipo mesenquimal. Curiosamente, los estudios recientes sugieren que las células mesenquimales en los riñones dañados presentan un perfil de expresión similar a la de las células mesenquimales en el desarrollo 14. Varios informes han detectado cambios en las moléculas de adhesión celular, proteínas de la matriz, citocinas y quimiocinas. A raíz de la propuesta para la transición mesenquimal epitelial, las células montamos sobre una membrana basal tubular y reiniciar las actividades del epitelio. La determinación de los genes importantes en este proceso sigue siendo un tema de investigación de nuestro laboratorio y otros. Gran parte del trabajo para dilucidar los factores clave en este proceso que queda por hacer, pero los avances significativos en el campo ha sido anunciada por el estudio de los efectos de la gentamicina.
AKI y fallo renal causado por la gentamicina es relevante teniendo en cuenta la prevalencia de los compuestos nefrotóxicos utilizados en la medicina 15. Se utiliza como un tratamiento para gram-negativos infecciones bacterianas, la administración de aminoglucósidos conduce a una lesión aguda en el 10-25% de los casos. La droga causa una gran cantidad de efectos negativos sobre el celular, así que resulta en la apoptosis o necrosis en muchas células tubulares. Los estudios han encontrado que la droga se unen preferentemente a un complejo formado por megalina y cubulin que está involucrado en la endocitosis. Estas moléculas se encuentran en abundancia en las células epiteliales del túbulo proximal, aunque no se limitan a la expresión en estas células. A través de la señalización celular que resulta en la inducción de estrés oxidativo, la liberación de vasoconstrictores, el agotamiento de ATP celular, la hipoxia, la inhibición de las fosfolipasas, los antibióticos gentamicina y similares causanapoptosis y necrosis en las células epiteliales. Además, los antibióticos desencadenar la contracción mesangial en la sangre nefrona filtro (glomérulos), lo que resulta en una caída en la tasa de filtración glomerular y negativamente alterando la capacidad del riñón para filtrar la sangre. La producción de especies reactivas del oxígeno, moléculas inmunoestimulantes, y la activación de las fosfolipasas tienen efectos difusos en la nefrona, la creación de una catastrófica patología que lleva a la insuficiencia renal aguda.
Mientras que los estudios con antibióticos gentamicina y similares han sido y seguirán siendo herramientas importantes para la investigación renal regeneración, carecen de una precisión que puede ser útil en el tratamiento de determinadas cuestiones. Nuestro sistema de usar el pez cebra, junto con un método de ablación láser se describe en este protocolo responde a la necesidad de una herramienta de investigación precisa. La ablación con láser permite a los investigadores para inducir la destrucción de las células en las áreas focales del túbulo renal, que van desde una pequeña (2-3) a grandes (> 50 a 100) la población, con una precisión inigualable. En este protocolo, utilizamos un método previamente desarrollado de la exposición a dextrano conjugados para etiquetar preferentemente poblaciones túbulo proximal del epitelio. Por otra parte, el pez cebra transgénico líneas que expresan la proteína verde fluorescente en una o más regiones del túbulo se podrían utilizar. Por ejemplo, cadherin17: eGFP pez cebra transgénico presentan fluorescencia fuerte en las regiones del túbulo distal (aunque débil en las poblaciones proximal), y podría ser valiosa para los estudios de regeneración en los segmentos de los túbulos otros 16. La visibilidad de la nefrona permitirá lapso de tiempo de grabación de vídeo de los cambios celulares en el tiempo. Cuando se combina con estudios de expresión génica, tales como montar toda la hibridación in situ o inmunohistoquímica, los investigadores pueden detectar alteraciones moleculares en la nefrona en el tiempo. En conjunto, estas estrategias se pueden empezar a formular una comprensión más dinámica de los acontecimientos que suceden en las células epiteliales renales son destruidos.
La principal advertencia de nuestro modelo de ablación con láser es que puede recapitular aspectos parciales de las condiciones fisiológicas que suceden en humanos AKI. La muerte celular inducida por los daños físicos instantánea es diferente de la cascada de eventos que conduce a la necrosis de las células, y como tal, los factores humorales en estos microambientes diferentes no pueden ser idénticos. Además, existe evidencia de la apoptosis inducida durante el daño renal, y no se sabe si tales consecuencias transpirar insulto siguientes con un láser. Sin embargo, al igual que el cultivo celular es una herramienta que mejor responde a algunas preguntas que requieren un entorno muy controlado, la ablación por láser servirá como un muy controlado en el modelo in vivo de la IRA. Por lo tanto, las percepciones recogidas de estudios de la ablación renal epitelial en el pez cebra es probable que promueven el descubrimiento de las ideas fundamentales que se pueden aplicar a las investigaciones de otras lesiones renales y, potencialmente, para crear un mejor diagnóstico en seres humanos.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wingert útil para los debates de la biología y las técnicas de AKI pez cebra, y Diep C. por compartir su receta de metilcelulosa. Los autores también desean expresar nuestra gratitud a los miembros del personal del Centro de Notre Dame para la Investigación de pez cebra para proporcionar una excelente atención permanente para la cría de nuestra colonia de pez cebra. La financiación del premio NIH NIDDK conceder DK083512 y de laboratorio generosa financiación inicial de la Universidad de Notre Dame, apoya este trabajo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Platos de embriones | Halcón | 35-1005 | |
| Pinzas de disección | Roboz | RS-5010 | |
| Agujas de inyección | Sutter Instrumentos | BF100-50-10 | |
| Agarosa ultrapura | Invitrogen | 16500-500 | |
| (40 kDa) Dextran-fluoresceína | Invitrogen | D1845 | |
| Pipeta de plástico | Samco Científico, Fisher | 204, 13-711-23 | |
| Tricaína | Sigma | E10521 | |
| Metilcelulosa | Sigma | M0262 | |
| La depresión de diapositivas | Pescador | S175201 | |
| De 12 y plato | Corning | 3512 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
