Se describe un método para procesar y la pantalla de campo recogidos mosquitos para una diversidad de virus mediante el ensayo de cultivo de células Vero. Mediante el empleo de esta técnica, hemos detectado nueve virus distintos de 4 familias taxonómicas de mosquitos recogidos en Connecticut.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero
En este artículo
Resumen
Resumen
Los mosquitos transmiten una serie de virus distintos incluyendo importantes patógenos humanos, tales como virus del Nilo Occidental, el virus del dengue y el virus de chickungunya. Muchos de estos virus se han intensificado en sus rangos endémica y se expandió a nuevos territorios, que requieren de programas efectivos de vigilancia y control para responder a estas amenazas. Una estrategia para controlar la actividad del virus consiste en recolectar una gran cantidad de mosquitos de los sitios endémicos y ponerlos a prueba para la infección viral. En este artículo se describe cómo manipular, transformar, y la pantalla de campo recogidos por los mosquitos del virus infeccioso por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos son ordenados por ubicación trampa y especies, y se agrupan en las piscinas que contienen ≤ 50 personas. Muestras agrupadas se homogeneizan en solución salina usando un mezclador de molino y la fase acuosa se inocula en cultivos de células Vero confluentes (clon E6). Los cultivos celulares son monitoreados por efecto citopático a partir de 3-7 días después de la inoculación y cualquier tipo de virus en cultivos celulares son identificados por los ensayos de diagnóstico apropiadas. Mediante la utilización de este enfoque, hemos aislado nueve virus distintos de los mosquitos recolectados en Connecticut, EE.UU., y entre ellos, 5 son conocidos por causar enfermedades humanas. Tres de estos virus (virus del Nilo Occidental, el virus de Potosí y La Crosse virus) representan nuevos registros para América del Norte o de la región de Nueva Inglaterra desde 1999. La capacidad de detectar una amplia variedad de virus es fundamental para control establecidos y los virus de reciente aparición en la población de mosquitos.
Protocolo
1. Mosquito clasificación e identificación
- Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un banco de laboratorio abierto en una dedicada nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) de laboratorio por personal capacitado para trabajar con los mosquitos viven. Una "cadena de frío" se mantiene durante todo el procedimiento.
- Anestesiar a vivir los mosquitos adultos mediante la colocación de bolsa de recolección de mosquitos en un congelador de -20 º durante 5 minutos. Transferencia de bolsa de recolección de un recipiente aislado que contiene hielo seco. Cierre la tapa y exponer a los mosquitos a los de dióxido de carbono durante 1-3 minutos para asegurar la....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
De células Vero ensayo de cultivo sirve como un método eficaz para los mosquitos pantalla de campo recogidos por la diversidad de virus. Esto contrasta con los métodos moleculares que apuntan específicamente a uno o unos pocos virus de interés. Por otra parte, hemos encontrado que la prueba de cultivo celular Vero es, si no también más sensible que la RT-PCR 7 y nos proporciona cepas de virus que se almacenan en nuestra colección de referencia para futuros estudios. Sin embargo, los sistemas de cultivo celula.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos la importante contribución de los Dres. John Anderson, Andrew principal y Shirley Tirrell a este estudio. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (U50/CCU116806-01-1) y el Departamento de Agricultura de EE.UU. (58-6615-1-218, CONH00768 y CONH00773).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / equipo | Empresa | Número de catálogo | |
| De suero fetal bovino | Gibco - Invitrogen | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco - Invitrogen | 15240 | |
| De bicarbonato de sodio NaHCO3, 7,5% sol.. | Gibco - Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamina 200 mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 | |
| Polvo medio mínimo esencial (MEM) | Gibco - Invitrogen | 11700 | |
| 10 veces más de Dulbecco PBS | Gibco - Invitrogen | 14080 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco - Invitrogen | 15400 | |
| Suero de conejo | Gibco - Invitrogen | 16120 | |
| Las células Vero (clon E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Pequeños frascos de cultivo de tejidos, tapones ventilados, 25 cm 2 | Falcon - Becton Dickinson | 353112 | |
| Grandes frascos de cultivo de tejidos, tapones ventilados, de 175 cm2 | Falcon - Becton Dickinson | 353108 | |
| De cobre recubierto de BB, de 4,5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| IsoPack bastidores congelador | Eppendorf | 022510240 |
Referencias
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
