Mutagénesis y análisis de mutaciones genéticas en la secuencia del receptor GC-ricos KISS1 identificado en el hombre con Trastornos del aparato reproductor

Resumen

Las mutaciones en el receptor kisspeptina (KISS1R) se asocian con trastornos de la reproducción en los pacientes. A continuación se describe la forma de introducir las mutaciones de interés en la secuencia rica en GC de KISS1R, así como el uso de construcciones KISS1R para caracterizar la vía de degradación del receptor por inmunoprecipitación y Western Blot

Resumen

El receptor de kisspeptina (KISS1R) es una proteína G-receptor acoplado reconocido como el desencadenante de la pubertad y un regulador de la competencia reproductiva en la edad adulta ^1,2,3. Inactivación de las mutaciones en KISS1R identificados en los pacientes han sido asociados con el hipogonadismo hipogonadotrópico iodiopathic (IHH) ^1,2 y la pubertad precoz ^4. Estudios funcionales de estos mutantes son cruciales para nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la regulación de la reproducción de este receptor, así como los que dan forma los resultados de la enfermedad, que resultan de la señalización KISS1R anormal y la función. Sin embargo, la secuencia altamente rica en GC del gen KISS1R hace que sea bastante difícil de introducir mutaciones o amplificar el gen que codifica este receptor por PCR.

Aquí se describe un método para introducir mutaciones de interés en esta secuencia muy rica en GC que ha sido utilizado con éxito para generar más de una docena de mutantes KISS1R en nuestro laboratorio. Hemos optimizado las condiciones de PCR para facilitar la ampliación de una serie de mutantes KISS1R que incluyen sustituciones, eliminaciones o inserciones en la secuencia KISS1R. La adición de una solución de PCR potenciador, así como de un pequeño porcentaje de DMSO fueron especialmente útiles para mejorar la amplificación. Este procedimiento optimizado puede ser útil para otros GC-ricos y plantillas.

El vector de expresión que codifica la KISS1R se ha utilizado para caracterizar la señalización y la función de este receptor con el fin de entender cómo las mutaciones pueden cambiar KISS1R función y llevar a los fenotipos asociados reproductiva. En consecuencia, las posibles aplicaciones de los mutantes KISS1R generado por mutagénesis dirigida se puede ilustrar con muchos estudios ^1,4,5,6,7,8. A modo de ejemplo, la mutación de ganancia de función en el KISS1R (Arg386Pro), que está asociada con la pubertad precoz, se ha demostrado que prolonga la capacidad de respuesta del receptor a la estimulación ligando ^4, así como para alterar la velocidad de degradación de KISS1R ⁹ . Curiosamente, nuestros estudios indican que KISS1R se degrada por el proteasoma, a diferencia de la degradación lisosomal clásicos descritos para la mayoría de G receptores acoplados a proteínas ^9. En el ejemplo que aquí se presenta, la degradación de la KISS1R se investiga en células de riñón embrionario humano (HEK-293) que expresan transitoriamente Myc-etiquetados KISS1R (MycKISS1R) y tratados con inhibidores del proteasoma o lisosomas. Lisados ​​celulares se immunoprecipitated agarosa usando un conjugado de anticuerpos anti-myc seguido por análisis de Western blot. Detección y cuantificación de MycKISS1R en transferencias se realiza mediante el sistema Odyssey LI-COR infrarrojos. Este enfoque puede ser útil en el estudio de la degradación de otras proteínas de interés.

Protocolo

1. Mutagénesis dirigida de secuencia altamente rica en GC gen KISS1R

1. Plantilla: secuencia completa de ADNc de la KISS1R humanos con Myc-tag fusionada a su extremo N-terminal. Esta secuencia se clonó en el vector de expresión pCS2 +, que es compatible con las líneas de células de mamíferos utilizan posteriormente para la transfección. Este vector de expresión se hace referencia en este documento como pCS2 KISS1R ⁺ Myc.
2. Diseño de la cartilla: primers están diseñados para llevar a mutaciones deseadas, de acuerdo a las instrucciones del kit QuikChange mutagénesis dirigida (Stratagene). En resumen:
   • Los dos primers....

Discusión

Mutagénesis dirigida se ha utilizado para estudiar la función de proteínas mediante la introducción de cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación de los genes blanco de más de tres décadas. La técnica original fue descrita en 1978 por el químico británico-canadiense y ganador del Premio Nobel Michael Smith ^10. Michael Smith compartió el 1993 Premio Nobel de Química con Kary Mullis, el bioquímico estadounidense que inventó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ^11. El método origin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
10x PCRx Reforzador Solución	Invitrogen	52391
PfuUltra de alta fidelidad de la polimerasa de ADN Alternativa detergente	Stratagene	600385
DPN-I	New England Biolabs	R0176
XL10-Gold Ultracompetent E. células de E. coli	Stratagene	200314
DMEM	Cellgro	10 a 013 CV
De suero fetal bovino	Atlanta Productos Biológicos	S11550
Geneporter Transfection Reagent	Genlantis	T201007
Leupeptina	Calbiochem	108975
MG132	Calbiochem	47491
10xPBS	Ambion	AM9625
Cóctel de inhibidores de la proteasa y PMSF	Santa Cruz de Biotecnología	Sc-24948
Pierce BCA Protein Kit de ensayo	Thermo Scientific	23225
anti-Myc etiqueta (clon 4A6) de agarosa conjugada	Millipore	16-219
2x tampón de carga	BioRad	161-0737
Criterio de Tris-HCl prefabricados gel, 4.15% de gradiente	BioRad	345-0028
Immobilon-FL membrana de PVDF	Millipore	IPFL00010
Odyssey tampón de bloqueo	LI-COR Biosciences	927-40000
10xTBS	BioRad	170-6435
Conejo anti-myc anticuerpos	Señalización celular	2272
Cabra anti-conejo IRDye 800CW	LI-COR Biosciences	926-32211
Imagen infrarroja del sistema Odyssey	LI-COR Biosciences
Proteasa Inhibidor de detener Cocktail (100 veces)	Thermo Scientific	78430