Se demuestra la fabricación de una etapa criogénica de bajo costo diseñado para adaptarse a la mayoría de los microscopios de luz reflejada. Esta etapa criogénica de laboratorio permite construir imágenes correlativas eficiente y confiable entre la luz y la crio-crio-microscopía electrónica.
Artículo de método
Bajo Costo Cryo-microscopio de luz para la luz de la etapa de fabricación correlacionadas / Microscopía Electrónica
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Resumen
Resumen
El acoplamiento de la crio-microscopía de luz (crio-LM) y la crio-microscopía electrónica (crio-ME) plantea una serie de ventajas para la comprensión de la dinámica celular y ultraestructura. En primer lugar, las células se pueden leer en un ambiente casi nativo para ambas técnicas. En segundo lugar, debido al proceso de vitrificación, las muestras se conservan por la inmovilización rápida física en lugar de fijación química lenta. En tercer lugar, la imagen de la misma muestra con tanto crio-LM y la crio-ME ofrece la correlación de los datos de una sola célula, en vez de una comparación de "muestras representativas". Aunque estos beneficios son bien conocidos a partir de estudios previos, el uso generalizado de la correlativa crio-LM y la crio-EM sigue siendo limitada debido al costo y la complejidad de la compra o la construcción de una adecuada etapa criogénica microscopía de luz. Aquí se demuestra la asamblea, y el uso de una etapa criogénica barato que se puede fabricar en cualquier laboratorio de menos de $ 40 con piezas encontradas en las ferreterías y tiendas de comestibles. Esta etapa de la crio-LM está diseñado para su uso con microscopios de luz reflejada que están equipados con mucho trabajo los objetivos de distancia aérea. Por correlativas crio-LM y los estudios de la crio-ME, que adaptar el uso de carbono con recubrimiento estándar de 3 mm de la crio-ME redes como soporte de la muestra. Después de adsorción de la muestra a la red, los protocolos previamente establecidos para vitrificar la muestra y transferir / manejo de la red se siguen para permitir múltiples técnicas de imagen. Como resultado, esta configuración permite que cualquier laboratorio con un microscopio de luz reflejada para tener acceso a imágenes directas correlativo de muestras congeladas de hidratación.
Protocolo
1. Fabricación y Montaje
- Coloque el disipador de calor de aluminio en el interior del 22,96 cm (9 ") molde de aproximadamente 2 cm por el lado de la olla, como se muestra en la Figura 1c El uso de un rotulador negro, marque los agujeros para el disipador de calor de aluminio Nota:.. Si el aluminio bloque (comprado en una tienda de chatarra local o en línea en http://www.onlinemetals.com ) no viene con los agujeros previamente perforados, tendrá que hacer arreglos para que los agujeros perforados y avellanados antes del paso 1 para obtener el aluminio bloque para el molde. Utilizamos cinco agujeros para fijar el bloque a la plataforma y cuatro agujeros extra para permitir que las burbujas de gas nitrógeno para escapar de debajo de la de aluminio.
- Coloque la caja de la crio-red cerca de la ubicación del disipador de calor de aluminio y marcar la primera categoría y de cada lado.
- Perforar agujeros piloto para cada posición marcada con una broca # 17 para perforar los agujeros de lavabo de calor de aluminio y una broca # 35 para perforar los agujeros de caja de la crio-red.
- Montar el disipador de calor de aluminio con 5 - N º 10, de 1,9 cm (3 / 4 ") de cabeza plana tornillos y tuercas con ranuras correspondientes, así como 15 - # 10 arandelas Coloque dos arandelas debajo del bloque de aluminio y la tercera en la parte posterior de la. molde para cada agujero Nota:. voladizos sin garantía del bloque de aluminio, cerca del área de visualización puede dar lugar a vibraciones que limitan las capacidades de imágenes de la etapa de verificación para asegurarse de que todos los tornillos de montaje están bien apretados..
- Inserte 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") alrededor de los tornillos y las tuercas con ranuras correspondientes de la parte trasera del molde para que actúe como caja de montaje en la crio-red.
- Cinta 4 palillos de dos en dos con un palillo encima del otro. Cinta de cada par de extremos opuestos de la torta de pan de actuar como separadores.
- Humedecer la superficie superior e inferior de la tarta y la tarta de las cacerolas, respectivamente, con ddH 2 O.
- Llenar el molde con dos capas de aislante de espuma aerosol. Mojar cada capa antes de ir al siguiente paso.
- Presione el molde en la espuma.
- Da la vuelta al revés y las cacerolas de prensa en el molde hasta que los separadores en contacto con el molde. Coloque ningún objeto pesado encima de la torta de pan y dejar reposar toda la noche para curar.
- Con un cuchillo de sierra, cortar el exceso de secado spray de espuma aislante del borde de los moldes y retire los palillos.
- Retire el molde de la tarta de pan. El molde de aluminio con disipador de calor está aislado y se conoce como la "etapa criogénica" (Fig. 1a).
- Coloque un tablero de plástico transparente (de cualquier color y mayor de 3 mm de espesor) en la parte superior de la etapa criogénica. Marca con un marcador negro la ubicación de la Caja de montaje en la crio-rejilla dibujando un círculo alrededor de 1,5 veces el diámetro de una sola ronda de crio-grid caja. Cortar el orificio con un 1,9 cm (3 / 4 ") sierra de perforación. Este portapapeles se conoce como la" pantalla de carga "(Fig 1b).
- Ponga un tablero transparente nuevo en la cima de la etapa criogénica y el lugar en el microscopio con el disipador de calor directamente en las lentes del objetivo. Con un marcador negro, marca el camino de los objetivos a medida que rotan.
- Corte a lo largo de la línea marcada la eliminación de un semicírculo desde el borde del portapapeles. Esto se puede lograr con una sierra o con un 7.62 cm (3 ") el agujero vio varias veces, como se muestra en el video.
- Finalmente hizo un agujero de 1,9 cm (3 / 4 ") de distancia del semicírculo, pero aún dentro de la zona del plato. Este será el puerto para la recarga de nitrógeno líquido (LN 2) si al mismo tiempo que bajan los niveles de imagen. Esta portapapeles se refiere como la "pantalla de visión" (Fig. 1c).
2. Preparación de la muestra
- Diluir registro de las células de levadura cultivada en fase sintético completo (SC) los medios de comunicación a una concentración adecuada de 1x10 6 células / ml en agua.
- 2 ml de la levadura diluida con pipeta a un R2 / 1 400 mallas perforadas de carbono recubiertos de cobre crio-ME red (SPI Supplies, West Chester, PA) y se deja absorber durante 15 segundos.
- Borrar lejos el exceso de líquido de la superficie de la rejilla al tocar el fondo de la parrilla a un trozo de tejido de celulosa blanda (Kimwipe) durante 2 segundos.
- Si es necesario, la red se pueden lavar con 3 gotas l de agua (1-3 veces), y el malo de distancia como en el paso 3 por transferencia de la parte posterior.
- Antes del último lavado, la muestra se carga en el congelador caída neumáticos y la red colgando se lava como en el paso 2.4. Después de borrar la parrilla con un pañuelo de papel rasgado (Kimwipe) para eliminar la mayor parte del agua de la superficie, la red se hunde en la LN 2 etano líquido refrigerado y trasladado a una caja de crio-red para el almacenamiento Nota 1:. Es importante dejar una capa de líquido lo más fina posible sobre la superficie para mantener hidratada la muestra. Inadecuado secante o se seca la muestra o dejar de hielo que es opaco a los electrones.
3. Cryo-microscopio de luz
- Llene la etapa criogénica conln 2 y cubrir rápidamente con la pantalla de carga (portapapeles de plástico con solo 1,9 cm (3 / 4 ") el agujero).
- Una vez que el metal alcance la temperatura ln 2, la transferencia de la caja de la crio-a través de la red de 1,9 cm (3 / 4 ") el agujero de la pantalla de carga y en la transferencia de montaje creado por los 3 tornillos que se describe en el A5 parte. Desenrosque la caja de la crio-red de su soporte y quitar el soporte para mejorar el acceso. Mantenga el titular de la caja de la crio-red con arreglo a ln 2 por separado en un termo hasta el paso 3.10. El cuadro de la crio-red también debe ser objeto de ln 2 para evitar el calentamiento de la muestra la cuadrícula.
- . Rellenar ln 2 en la etapa criogénica hasta justo debajo de la parte superior del disipador de calor de aluminio Nota: en dos niveles deben ser controlados periódicamente y rellenados durante el proceso de formación de imágenes para asegurarse de ln 2 está continuamente en contacto con el disipador de calor. En general, la recarga se produce cada 10 minutos a través del puerto de llenado en la pantalla de visualización.
- Pre-enfriar la punta de la pinza en la NL 2, entonces la transferencia de la cuadrícula (s) en la superficie de visión plana del disipador de calor de aluminio con pinzas, con el 1,9 cm (3 / 4 ") el agujero de la pantalla de carga.
- Cuidadosamente mueva el crio-etapa de debajo de las aberturas objetivo del microscopio de luz reflejada.
- Coloque la pantalla de visualización transparente sobre la pantalla de carga. Luego, lentamente, quitar la pantalla de carga, deslizándola por debajo de la pantalla de visualización. Nota: En este punto, la muestra es más vulnerable. Todas las corrientes de aire alrededor del microscopio debe ser minimizado, incluyendo la respiración, una puerta cercana, gente caminando pasas, etc Le sugerimos usar una mascarilla o colgar una careta transparente debajo del microscopio oculares como medida de precaución.
- Gire la lente objetivo en el medio ambiente de nitrógeno gas frío de la crio-escenario y análisis de la muestra en el área de visualización plana calor fregadero. Los métodos habituales de la luz brillante microscopía de campo técnicas se centran en la red con un objetivo de bajo aumento para encontrar el centro y tener una imagen general. Especificaciones relativas a las lentes de microscopio de luz utilizada para este experimento se muestran en la sección de materiales experimentales. Nota: ln 2 no entran en contacto con las lentes del objetivo y todavía tenemos que ver la degradación de las imágenes o los daños a las lentes de los efectos de enfriamiento .
- Enfoque en el gran aumento en un área de interés y adquirir datos de campo claro, campo oscuro, la luz polarizada o imágenes de fluorescencia. Asegúrese de registrar la ubicación del área de interés en la imagen de campo de bajo aumento de la correlación brillante futuro. Si todas las precauciones mencionadas anteriormente para rellenar el ln 2 se siguen, entonces la presión positiva de la evaporación de nitrógeno es suficiente para mantener un ambiente libre de contaminación (independiente de la humedad del ambiente) para la duración de la imagen.
- Una vez terminado, vuelva a colocar la pantalla de carga de deslizamiento sobre la parte superior de la pantalla de visualización. Quitar la pantalla de visualización de la desaceleración deslizándola por debajo de la pantalla de carga.
- Retire la etapa criogénica del microscopio y con pre-enfriado pinzas, la transferencia de la red a la caja de la crio-red. Atornille el soporte de caja de la crio-red en la crio-grid caja para sellar contra el medio ambiente y la transferencia a su titular un dewar LN2 para el almacenamiento y las imágenes en el futuro.
4. Crio-microscopía electrónica
- Siguiendo las técnicas estándar y estableció, la carga de la red de la muestra en un soporte de transferencia de la crio-ME, manteniendo la muestra a la temperatura del nitrógeno líquido en todo momento.
- Inserte el titular de la crio-con la red de la muestra en un microscopio electrónico de transmisión.
- En una vista de la ampliación adecuada de baja (50-500x aumentos nominales), encontrar el centro de la rejilla de la muestra.
- Utilice la recogida previamente bajo magnificación LM crio-los datos de paso de 3,7 a determinar la orientación relativa de las fichas de la cuadrícula central de cobre (como se describe en la figura 2) e identificar las áreas exactas de interés para la correlación.
- Proceder a la alineación microscopio, dosis bajas de imágenes crio-ME y la recolección de datos.
5. Resultados representante
La etapa criogénica (Fig. 1a) es una manera efectiva para reunir datos de la crio-LM para la crio-microscopía de fluorescencia y análisis cryo-LM/cryo-EM correlativa. La figura 2 muestra cómo la combinación de bajo y alto aumento de la crio-LM imágenes le permite crear mapas de referencia que le llevan a las áreas específicas de la crio-ME. El resultado de la crio-LM referencia en el mapa (figura 2b) se utilizó durante la crio-ME de adquisición de datos para localizar las regiones exacto que se muestra en la Figura 3.
Figura 1. Etapa criogénica. A) El diseño de la etapa criogénica consiste en una caja de transferencia crio de la red de montaje indicado won una flecha blanca y un disipador de calor de aluminio. Las rejillas son transferidos bajo ln 2 de la caja de la crio-red y se colocan directamente en el área de visualización del disipador de calor como indica la flecha negro. B) de la imagen que representa la etapa criogénica con la pantalla de carga. El agujero en la pantalla de carga se coloca directamente sobre la caja de montaje en la crio-red y actúa como un puerto de transferencia de muestras y para mover las muestras de la caja de la crio-red para el área de la muestra la visualización en el disipador de calor con unas pinzas. C) La criogénica etapa en la posición en las lentes del objetivo con la pantalla de visualización en su lugar. La corte especial en la pantalla de visualización permite a las lentes del objetivo a oscilar con facilidad en la posición sin mover la etapa criogénica. El agujero en la pantalla de visualización de la zona de la muestra actúa como un puerto de llenado ln 2 ln 2 para reponer los niveles si es necesario.
Figura 2. Navegación en la crio-LM de estudios que los relacionan. A) bajo aumento de la crio-LM vista de las células de levadura se adhirió a una red de muestreo. B) La misma imagen en (a) cubierta con una imagen de gran aumento de fluorescencia de un área de interés y con un polígono relleno de color naranja que marca el centro de la rejilla de la muestra. El centro consiste de un grupo de cuatro plazas, tres tienen una lengüeta metálica adicional y al aire libre etc. Para las tres plazas con una lengüeta de metal extra, dos pares de compartir la ficha de alrededor de los ejes largo y corto formando un centro asimétrico. Este centro asimétrico se puede ver en la esquina superior izquierda y se utiliza para indicar el ángulo de rotación y la imparcialidad de la red entre la crio-LM y la crio-EM. Desde una de las áreas de baja magnificación de la imagen de interés turístico se pueden marcar y se utiliza como un mapa de referencia para localizar áreas idénticas en la crio-ME. C) Una magnifica fluorescencia crio-LM imagen de la zona de interés en (b). HTA1-PPC, un marcador de c-terminal de la histona PPC, puede ser visto como una estructura verde punteada de etiquetado de la ubicación del núcleo. D) Una imagen de la crio-ME de la zona correspondiente (c). Las barras de escala representan el 50 micrones.
Figura 3. Correlación de la crio-LM y la crio-EM. Dos campos de visión que representan las células de levadura idéntica correlación con la crio-campo claro (a, d), la crio-fluorescencia (b, e), y la crio-EM (c, f ). Las barras de escala representan el 5 micrones.
Discusión
Uso de nuestra etapa criogénica y técnicas de preparación de muestras, estudios que los relacionan entre crio-LM y la crio-EM presentan varias ventajas sobre los enfoques tradicionales de la temperatura ambiente, incluyendo pero no limitado a: fijación rápida 1,2, La reducción de photobleaching 3, Y el escaneo de la integridad de la muestra antes de la crio-ME 4,5 O químicos fijación / incorporación de 6. Uno de los cuellos de botella para la crio-ME de recopilación de datos es el tiempo necesario para que tanto la transferencia de la muestra en un TEM y el escaneo de la red para encontrar las regiones aptas para la imagen. Con la rápida adquisición de la crio-LM de datos 5, El tiempo para encontrar las células buenas se pueden reducir considerablemente. Por lo tanto, se puede ahorrar tiempo y dinero y reducir este cuello de botella por el pre-escaneo y cartografía de zonas de interés en la crio-LM.
Criogénico Las etapas más costosas o complejas pueden permitir una mayor resolución de imagen crio-LM. Sin embargo, el escenario fabricado aquí es más que suficiente para muchas aplicaciones. Si la crio-LM muestra de imágenes y transferencia de la red se realizan con cautela como se describe en el texto y video, imagen totalmente libre de contaminación se puede lograr. Este método permite la relación directa de los datos de microscopía de fluorescencia y electrónica de la misma célula, orgánulo o complejo macromolecular dispersos en el soporte de carbono o contenidos dentro de una sección de tejido fino 7. Cabe señalar que el valor de esta etapa criogénica se extiende más allá cryo-LM/cryo-EM estudios que los relacionan con el campo de la microscopía de luz en su conjunto. Esta etapa criogénica es muy adecuado tanto para muestras delicadas y tintes fluoróforo / manchas 8 Puntos Cuánticos, o proteínas marcado con fluorescencia 9 Que puede ser inestable durante la fijación química a temperatura ambiente y la inclusión con glutaraldehído y paraformaldehído. Como resultado, esperamos que esta etapa criogénica ofrecerá mayor acceso a los interesados en la crio-LM, que previamente han sido disuadidos por los costos de acceso e insuficiente.
Solución de problemas Cryo-microscopio de luz
1. Muestra de adsorción: Las diferentes muestras pueden presentar variables características de adsorción para el apoyo de carbono. Puede que le resulte necesario utilizar otros tipos de redes de apoyo, tales como carbono continua, llena de agujeros de carbono, o formvar rejillas recubiertas de apoyo de la muestra. Además, si la muestra es vinculante para las barras de cobre de la red y no la superficie del carbón, puede ser necesario ajustar la química de la superficie de carbono mediante la incubación de la red con un agente humectante o por el desempeño de brillo antes de la adición de la muestra.
2. Etapa de estabilidad: Si usted nota la vibración, es muy probable debido a la etapa de la muestra está sobrecargado de peso en lugar de las burbujas de LN2. El peso añadido de la etapa criogénica, a veces puede causar vibraciones de baja frecuencia para transmitir a lo largo de la norma de 3 ejes platina del microscopio de viaje, y afectar negativamente la imagen a través de imágenes borrosas. Esto puede ser fácilmente corregido mediante el apoyo a la etapa del microscopio de viaje desde la parte inferior, ya sea con un mini-ajustable de elevación o de un adaptador ajustable con doble tornillo de armas, como se muestra en el video. Estos dos mecanismos de soporte ajustable interactuar con una parte no móvil de la etapa de los viajes y por lo tanto, sigue permitiendo X y la traducción del eje Y como se requiere para obtener imágenes.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Brandon J. Zipp y Ken B. Kaplan para facilitar el acceso a la cepa de levadura utilizada en este estudio. Los autores también agradecen Julio Lenin Domínguez Ramírez de asistencia con grabación en vídeo. JEE NIH reconoce el apoyo financiero de la subvención número 5RC1GM91755.
Materiales
Tabla de reactivos y equipos específicos:
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Nombre | Empresa | Catálogo # | Comentarios | Costo |
| 1 a 22,86 cm (9 ") molde con el borde de una pendiente | Buen cocinero | Tienda de comestibles | $ 4.39 | |
| 1 a 22,86 cm (9 ") torta de pan | Buen cocinero | Tienda de comestibles | $ 4.93 | |
| 4 pares de palillos | Tienda de comestibles | $ 0.50 | ||
| 1 - Gran spray de espuma cosas | Great Stuff | Ferretería local | $ 5.98 | |
| 1 - 4 cm x8cm x1cm bloque de aluminio | Ferretería local o en el patio de chatarra | $ 10.00 | ||
| 5 - # 10 1,91 cm (3 / 4 ") de cabeza plana con ranura tornillos w / tuercas | Ferretería local | $ 0,98 | ||
| 3 - # 4 0,95 cm (3 / 8 ") alrededor de los tornillos ranurados w / tuercas | Ferretería local | $ 0,98 | ||
| 15 - # 10 arandelas | Ferretería local | $ 0,98 | ||
| 2 - tablillas de plástico transparente | Tienda de la oficina local | $ 6.84 | ||
| 1 - Cryo-EM red cuadro titular | Ted Pella | 160-41 | N / A | |
| 1 - Cryo-EM celda de la malla barra de manejo | Ted Pella | 160-46 | N / A | |
| 1 - R2 / 1 película de carbón perforado, de 400 mallas de cobre crio-ME red de apoyo | SPI Supplies | 4340C-XA | N / A |
Materiales experimentales
- Cepa de levadura: Hta1-PPC:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, LYS2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-PPC:: KanMX6 del laboratorio de Kaplan Universidad de California en Davis).
- Cryo-microscopio de luz: Cryo-imágenes de microscopía de luz fueron tomadas con un microscopio Leica DM4000M que refleja con una Leica DFC310 FX CCD de la cámara. Campo claro, campo oscuro y las imágenes de fluorescencia fueron adquiridos utilizando un HCX PL Fluotar 5x 0.15 NA objetivo de aire, un HCX PL Fluotar 10x 0.30 NA objetivo de aire, un PL Fluotar 50x 0.55 NA objetivo de aire o un 0,75 NPLAN 100x objetivo NA aire. Campo brillantes e imágenes de campo oscuro utiliza una lámpara de tungsteno de 100W 12V como fuente de luz. De fluorescencia, una fuente de UV EL6000 lámpara se utiliza en conjunción con una Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 y LP 580) Cubo de filtro.
- Cryo-Microscopía Electrónica de Transmisión: Cryo-EM imágenes fueron adquiridas en un microscopio de transmisión JEM-2100-FEG electrónica (JEOL, Japón) que opera a 200 keV utilizando un Gatan 626 crio-la transferencia de titular (Gatan, EE.UU.). Micrografías se registraron aumentos en el nominal de los X 50, 200, 1.200 y 4.000 en 4096 x 4096 píxeles Tietz cámara CCD (TVIPS, Gauting, Alemania).
Referencias
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- Gaietta, G. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296, 503-507 (2002).
- Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. Markers for correlated light and electron microscopy. Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).
Reimpresiones y permisos
