Preparación de los adultos Drosophila Ojos de seccionamiento fino y análisis microscópico

Resumen

Un enfoque estándar para preparar a los adultos Drosophila Los ojos de semi-fino corte y el análisis al microscopio óptico se presenta aquí. El protocolo se puede utilizar para el análisis morfológico de los defectos del ojo, o con los ajustes indicados se puede utilizar para determinar los requerimientos de genética de genes en tipos celulares específicos del ojo (por ejemplo, análisis clonal de los fotorreceptores) o para el análisis de microscopia electrónica.

Resumen

Drosophila ha sido utilizado como sistema modelo para estudiar el desarrollo, principalmente debido a la facilidad con que es manejable de forma genética. Con los años, una gran cantidad de cepas mutantes y trucos técnicos se han desarrollado para permitir a las preguntas sofisticado para ser formuladas y contestadas en un plazo razonable de tiempo. Idea fundamental en la interacción de los componentes de todas las conocidas vías principales de señalización que se haya obtenido en avance y retroceso de los estudios genéticos Drosophila. El ojo de la mosca ha demostrado ser excepcionalmente adecuado para el análisis de las mutaciones, ya que, en condiciones de laboratorio, las moscas pueden sobrevivir sin los ojos funcionales. Además, la superficie del ojo de un insecto se compone de alrededor de 800 ojos de cada unidad (o facetas omatidios) que forman una superficie regular, lisa cuando se observan bajo un microscopio de disección. Por lo tanto, es fácil ver si una mutación podría afectar el desarrollo del ojo o el crecimiento por el exterior en busca de la pérdida de la superficie lisa (fenotipo "ojo áspera; Fig. 1.) O el tamaño total del ojo, respectivamente (para ver ejemplos de pantallas basadas en la morfología externa del ojo ver, por ejemplo ^1). Posterior análisis detallado de los fenotipos de los ojos requieren la fijación, la incorporación de plástico y delgado corte de los ojos de un adulto.

El ojo de Drosophila se desarrolla desde el disco de los ojos llamada imaginal, una bolsa de las células epiteliales que proliferan y se diferencian en las etapas de larva y pupa (para revisión ver por ejemplo ^2). Cada ommatidio consta de 20 células, entre ellas ocho fotorreceptores (las células de relaciones públicas o R;. Fig. 2), cuatro secreción de lentes células conos, células pigmentadas ("hexágono" en torno a R en células de racimo) y una cerda. Los fotorreceptores de cada ommatidio, más fáciles de identificar por sus orgánulos sensibles a la luz, el rhabdomeres, se organizan en un trapecio formado por los seis "de afuera" (R1-6) y dos "interior" fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] se encuentra debajo de R7 y por lo tanto sólo se ve en las secciones de las zonas más profundas del ojo). El trapecio de cada faceta es precisamente alineados con los de sus vecinos y los ejes anteroposterior y dorsoventral general del ojo (Fig. 3). En particular, el omatidios de la dorsal y ventral (flechas de color negro y rojo, respectivamente) mitades de los ojos son imágenes especulares uno del otro y se corresponden con dos formas quirales de señalización establecidos en la polaridad celular plana (para una revisión véase, por ejemplo ^3).

El método para generar semi-delgadas secciones de los ojos (como los presentados en la Fig. 3). Describe aquí es ligeramente modificada de la que inicialmente se describió por Tomlinson y Ready ^4. Permite el análisis morfológico de todas las células, excepto para las células cono transparente. Además, el pigmento de las células de R-(puntas de flecha azul en la figura. 2 y 3) se puede utilizar como un marcador de células autónomas para el genotipo de un R-célula, por lo tanto las necesidades genéticas de los genes en un subconjunto de R-células pueden fácilmente se determinará ^5,6.

Protocolo

1. Volar disección cabeza

1. Asegúrese de tener todos los materiales a mano (incluidos los portaobjetos recubiertos de gelatina). Preparar glutaraldehido y fijadores de osmio (ver más abajo). Por genotipo de integrar, alícuota de 200μl solución de arreglo de glutaraldehído en tubos de 1,5 ml en hielo.
2. Anestesiar a las moscas en la plataforma de CO ₂ (por lo general diseccionar siete cabezas vuelan a incorporar seis por genotipo en el caso de un jefe se destruye durante el procedimiento).
3. Mantener y presione ligeramente el tórax de la mosca, la parte dorsal para arriba, con las pinzas y el uso de un escalpelo afilado para cortar la cabeza.
4. Estabilizar la cabeza de mosca al tocar el cuello con las pinzas y con cuidado rebanar una pequeña parte de un ojo. Esto aumenta la penetración del fijador (si tiene intención de utilizar su buen ojo para las secciones de análisis clonal, le cortó el ojo con los clones no o menos). Evite tocar y dañar el ojo intacto que posteriormente se seccionó.
5. Toque la cabeza con unas pinzas o bisturí sobre la superficie del corte del ojo y la transferencia de la cabeza en fijador de glutaraldehído / fosfato en el hielo (los jefes suelen flotar en la superficie del aislante) Las cabezas disecadas no deben ser mantenidos en solución de glutaraldehído durante más tiempo de 15 minutos antes de la adición de osmio. Repita los pasos 1.2 a 1.5 con las otras moscas del mismo genotipo.

2. Fijación e inclusión (uso de guantes para todos los pasos!)

1. Haga girar la flyheads en centrífuga Eppendorf durante 1 minuto a 10.000 rpm. Continuar, incluso si los jefes no se hunden.
2. Agregar 200μl de solución de OsO ₄ y fijar, por lo menos 30 minutos y hasta 1 hora en hielo.
3. Con una pipeta Pasteur, retire la solución de glutaraldehído / osmio (asegúrese de usar los procedimientos adecuados de eliminación de residuos!) Y reemplazar con la solución de osmio 200μl. Incubar en hielo durante 1-6 horas. Asegúrese siempre de que las cabezas están completamente cubiertos con el líquido y no eliminar toda la solución, como la cabeza o los ojos se derrumbaran!
4. Con una pipeta Pasteur, deseche el fijador, se añaden 0,5-1ml etanol al 30% e incubar durante al menos 5 minutos en hielo (asegúrese de usar los procedimientos adecuados de eliminación de residuos ya que el etanol contiene osmio ahora!).
5. Repita el paso anterior con un 50%, 70%, (80%), 90% y el doble de etanol al 100%. Incluir la etapa de etanol al 80% si se utiliza la vista para el análisis de microscopia electrónica. Después de la etapa de lavado del 70%, las muestras se pueden quitar el hielo.
6. Vuelva a colocar el etanol con un volumen igual de óxido de propileno (volátiles, seguir trabajando en la campana). Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Repetir el lavado de óxido de propileno. Trabajar por lotes, si el procesamiento muchos genotipos en paralelo para evitar el colapso de los ojos debido a la evaporación del óxido de propileno.
8. Eliminar la mayor parte del óxido de propileno y con una pipeta de transferencia de plástico, añadir unos 500μl de una relación 1:1 de resina: La solución de óxido de propileno. Equilibre la noche a temperatura ambiente.

3. Incrustación y su colocación en moldes

1. Asegúrese de que todos los moldes están etiquetados para el seguimiento de sus genotipos diferentes, llenar los moldes con el 100% de resina. No llene en exceso (no 'montes altos "sobre la superficie de los moldes cuando se mira directamente a través de la superficie del molde). El uso de resina dura para el análisis de EM.
2. Con una pipeta de transferencia, eliminar la resina 50% de los jefes, reemplace con un 100% de resina, e incubar durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Mientras los jefes están infiltradas con resina, que se hunden hasta el fondo del tubo.
3. Con un palillo que se ha visto afectada en una superficie dura una vez para crear un pequeño gancho, la transferencia de una cabeza en el momento en un molde.
4. Coloque papel de aluminio en la zona de trabajo de su microscopio de disección para proteger contra derrames de resina.
5. Utilizando una aguja de disección y buscando aunque su ámbito de aplicación, haga girar la cabeza un poco en la resina y con cuidado se mueven en el fondo del molde cerca de la punta.
6. Alinee cuidadosamente la superficie de la intacta (!) Ojo (o su futuro avión de seccionamiento, si usted quiere tener secciones transversales) del cuello hacia abajo con la pared frontal del molde, asegurándose de mantener la superficie tangencial de los ojos aproximadamente la mitad de una cabeza diámetro de la pared del molde. En casos raros, un colapso del ojo que puede ser visto como un espacio vacío entre la superficie del ojo y la cabeza de la cutícula. Si usted tiene un ojo se derrumbó, reemplazarlo por el ojo ⁷ de repuesto.
7. Repita el procedimiento con todos los jefes. Una vez hecho esto con todas las alineaciones, vuelva a revisar todos los ojos para asegurarse de que no se movió al extraer la aguja de la resina.
8. Si tiene problemas con los ojos en movimiento cuando se quita la aguja de disección, la posición del ojo como se desee, de forma rápida retracción de la aguja un poco lejos de la cabeza y luego extraer la aguja lentamente por completo.
9. Hornee los moldes durante la noche a 70 ° C.

4. Corte y seccionamiento

1. Retire los bloques endurecidos de los moldes por la flexión de los moldes, keeping pista de qué bloque se corresponde con el genotipo (por ejemplo, tienda en viales de centelleo pequeño).
2. Para cortar, usar un plato apropiado para su microtomo que se monta boca arriba sobre un bloque de metacrilato o el aluminio. Monte el bloque de ajuste, hasta los ojos, en el plato.
3. En el ámbito de disección utilizando una navaja de afeitar teflón mandó, corte con cuidado sólo la capa superior de su bloque. Esto dejará una superficie transparente a través del cual usted debe ver el ojo y por lo tanto se puede predecir el futuro avión de la sección. Evitar cortar los dedos!
4. Cortar el exceso de plástico en ambos lados de la cabeza y en el frente (es decir, lo que solía ser la parte superior del molde cuando la alineación de los ojos) hasta que la mayoría del plástico en la cabeza es cortada. Lo mejor es acercarse poco a poco la cabeza, cortando varias capas delgadas de plástico.
5. Usando una hoja de afeitar limpia, retirar con cuidado las capas delgadas de la parte superior del ojo en el plano exacto que desea para más adelante (por lo general tangencialmente a la vista, con una ligera inclinación de la superficie del molde original).
6. Continúe hasta que usted acaba de empezar a cortar la superficie externa del ojo. Asegúrese de utilizar las áreas limpias de la hoja para obtener una superficie brillante, transparente, lo que hace más fácil la alineación en el microtomo.
7. Para ahorrar en cuchillas de afeitar, cuchillas de mayor uso para el crudo de recorte alrededor de los lados del bloque y el uso de una hoja fresca de la corte fino (primer corte y 4.6). Al final, usted tendrá una pirámide de tres lados con una ligera inclinación, de corte superior que corresponde a su plano de sección en el futuro.
8. Monte el bloque en el microtomo. Corte real puede variar dependiendo del tipo de microtomo y no se describirán en detalle aquí. Utilizamos un Sorvall MT5000 con un cuchillo de diamante para cortar histo calidad de 0,5 a 1μm secciones. Para el análisis microscópico de luz, pequeñas variaciones en el espesor de corte no tienen importancia. Si clones corte marcado por una sección blanca + transgén, 1μm secciones para asegurarse de tener suficiente gránulos de pigmentos junto a la rhabdomeres por sección (Fig. 2).
9. Secciones flotan sobre el agua. Levante primeros 20-30 secciones con un extremo aplanado de un Q-tip de madera de debajo de la superficie del agua en un movimiento de rotación y transferirlos a una gota de agua sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de gelatina (se guardan en una placa de calentamiento a unos 100 ° C ).
10. Repita con el otro 20 a 30 secciones. Espere hasta que el agua se haya evaporado y las secciones se adhieren a la diapositiva. Por lo general, las secciones de tres ojos dispuestos en tres columnas (tres ojos) por filas TWP (arriba / secciones inferiores) encajan bien en una diapositiva.

5. Tinción y análisis microscópico

1. A menos que los clones de la sección, secciones mancha. Lugar de diapositivas con las secciones de un bloque de calentamiento fijado en 90 ° C. Prescindir de toluidina azul solución de tinción de una jeringa de 30 ml conectada a un filtro de 0.22μm sobre el portaobjetos y teñir durante 10 segundos. Lavar inmediatamente ampliamente con agua destilada. Aire seco.
2. Con una pipeta de transferencia de plástico, distribuir 3 gotas de DPX medio de montaje sobre el portaobjetos y un cubreobjetos. Parte superior con tres monedas de diez centavos y dejar que el medio de montaje endurecer (por ejemplo durante la noche a temperatura ambiente).
3. Imagen al microscopio de luz. Utilice un objetivo de 5x o 10x para encontrar una buena sección y luego cambiar a una lente de 63x de inmersión en aceite para su análisis detallado y la fotografía. Por lo general, utilizar la configuración de contraste de fase, pero la óptica de campo oscuro funciona tan bien.

6. Los resultados representativos:

Con más frecuencia, los ojos están incrustados en plástico para un análisis detallado de los ojos externos fenotipos áspera detectado como parte de un examen genético o en el proceso de las pruebas de interacciones genéticas con genes conocidos por afectar tanto a la estructura general de los ojos o la polaridad. Los resultados típicos de las secciones de los ojos se muestran en la Figura 3. De tipo salvaje omatidios (Fig. 3) muestran el complemento completo de los fotorreceptores, rodeado por un entramado de células pigmentarias. Por el contrario, en un estrabismo (stbm, también conocido como van ^gogh-7) mutante, la polaridad ommatidial se pierde y, a pesar de que el complemento completo de los fotorreceptores está presente, la rotación y la quiralidad son asignados al azar (Fig. 3B). Por otra parte, ya que el alelo seccionado stbm estaba en aw ^- fondo, los gránulos de pigmento no se encuentran en la figura. 3B. La figura 3C muestra un ejemplo de un análisis clonal. Drosophila Rho-cinasa (Drok) es necesario para la rotación ommatidial, así como para la integridad estructural del ojo ^8. Homocigotos Drok ^dos clones se pueden identificar por la ausencia de pigmento en las células de pigmento y el rhabdomeres (por lo general, los clones son inducidas por el uso sin ojos-FLP y un P-elemento con un gen marcador fuertemente expresado blanco como complemento de una w de fondo ^- la mutación en la naturaleza tipo de tejido y heterocigoto). Por tanto, es posible identificar las áreas mutante por la falta de pigmento. Debido a la autonomía de las células de la pigmentación en la R-cells se mencionó anteriormente, los genotipos de cada uno de R-células puede determinarse (ver puntas de flecha en la figura. 3C).

Figura 1. El ojo de Drosophila es un excelente sistema modelo para los biólogos, ya que, en contraste con la superficie lisa de un ojo de tipo salvaje (A), la superficie de un ojo mutante es externamente con frecuencia en bruto (B), indicativo de los fenotipos de los ojos subyacente . En todas las figuras, es anterior a la izquierda y dorsal está arriba. Imágenes cortesía de la Dra. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, EE.UU..

Figura 2. Luz imágenes microscópicas de una sola omatidios seccionado utilizando el método descrito. Sólo siete R-células son visibles a la vez por omatidio, ya que R7 se encuentra en la parte superior del R8. (A, A ') En el plano R7, el cuerpo celular de R7 se detecta entre R1 y R6 (flecha amarilla en A'). En contraste, a nivel R8 (B), el cuerpo celular de R8 se detecta entre R1 y R2 (flecha amarilla en B '). Puntas de flecha azul marca los gránulos de pigmento que se puede utilizar como un marcador de pigmento en células autónomas.

Figura 3. Tangencial a través de las secciones de tipo salvaje (A), stbm (B) y Drok (C) los ojos de adulto mutante de Drosophila. Esquemas a continuación las secciones indican la polaridad de omatidios (ver (A) para las flechas). Los círculos representan omatidios con defectos en la dotación de los fotorreceptores. Las líneas amarillas representan la línea dorsal / ventral de la simetría (ecuador). En contraste con los omatidios bien orientado de tipo salvaje (A), la organización plana que se pierde en el mutante stbm (B). Tenga en cuenta que la sección de los mutantes stbm muestra carece de pigmento debido a su w ^- fondo mutante. (C) Debido a que las mutaciones son letales Drok, tienen que ser analizados en los clones. Así, las células pigmentadas de tipo salvaje o heterocigotos (lleno de puntas de flecha azul), mientras que R-carece de células pigmentarias (abierto puntas de flecha azul) son mutantes homocigotos. Además de los defectos de rotación, los mutantes Drok también muestran defectos estructurales, incluidos los números faltantes o en exceso de la R-células. Tenga en cuenta que para el análisis clonal, las secciones no están marcados para evitar ocultar los gránulos de pigmento.

Discusión

Con Drosophila como organismo modelo, las pantallas de genética llevó a la identificación de muchos de los miembros fundadores de familias de genes esenciales para la mayoría de las vías de señalización altamente conservados en eucariotas superiores incluidos los seres humanos. Ya que, en condiciones de laboratorio, un ojo funcional es prescindible para la supervivencia, el ojo es un tejido especialmente adecuado para el descubrimiento de las funciones de genes nuevos y la evaluación de las redes genéticas. El análisis ultraestructural del ojo de la mosca utilizando el método descrito así a los descubrimientos fundamentales relevantes para el desarrollo y la enfermedad. Inicialmente, el análisis clonal de células individuales se realizó a través de rayos X combinada con clones inducidos por conocidos estrechamente asociado células autónomas marcadores recesivos. Más recientemente, la disponibilidad del sistema de FLP / FRT para generar clones ha facilitado enormemente el análisis fenotípico de las mutaciones letales en ^6,9 secciones ojo.

El análisis de las secciones del ojo no se limita a los cortes tangenciales se describe aquí. Si lo desea, los jefes pueden ser alineados en cualquier orientación en los moldes y las secciones transversales se pueden obtener para estudiar las capas más profundas en la cabeza, como la lámina y la médula. El protocolo se describe aquí es, pues, un método versátil para el análisis de las estructuras de los adultos los ojos y la cabeza de Drosophila.

Materiales

Equipos de uso general:

• Para la cría de moscas en general véase el punto ¹⁰
• Microscopio de disección estándar (por ejemplo, Nikon SMZ-645 microscopio estéreo con zoom), preferiblemente con una fuente de luz del anillo para evitar que una sombra de tus manos.
• CO _{2 Fly} almohadilla, cubierto con papel Whatman 3MM para proporcionar una protección contra la suciedad durante la disección.
• Portaobjetos recubiertos de gelatina: se disuelven 10 g de gelatina y 1 g CrKSO ₄ x 12 H ₂ O en 1 litro de agua en una placa calefactora (llevar casi a punto de ebullición, es de aproximadamente 2 horas). Dip se desliza bien lavados (jabón) y enjuagados (DH ₂ O) en los titulares en la solución de gelatina y aire seco cubierto con papel de aluminio durante la noche.
• Horno de calentamiento (70 ° C; los antiguos hornos de vacío que se utiliza para el secado de nitrocelulosa filtro son adecuados para este propósito).
• Capaz de seccionamiento ultrafino (0,5 a 1 m de espesor) microtomo, por ejemplo, los utilizados por las instalaciones de microscopía electrónica. Utilizamos un Sorvall MT5000 ultramicrotomo con un cuchillo de diamante Histo calidad. Cuchillas de vidrio, también funcionan.

Soluciones de fijación:

• Prepare una solución madre de tampón fosfato 0,2 M de sodio, pH 7,2.
• Preparar glutaraldehido al 2% en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2 (se puede almacenar a 4 ° C durante 4 semanas). Hacer por lo menos lo suficiente para tener 200μl por genotipo que desea incrustar. Mantener en hielo.
• Solución de osmio: 2% OsO ₄ en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2. Haz sólo lo suficiente para tener 200μl por genotipo desea incrustar, ya que la solución no se puede almacenar. Mantener en hielo.

Glutaraldehido y _OsO4 son altamente tóxicos y deben manejarse con extremo cuidado en una campana bien ventilada. Use las puntas de filtro cuando se manejan _OsO4 para evitar el ennegrecimiento de la pipeta.

Deshidratación: Hacer 30%, 50%, 70% (80%), 90% y 100% de soluciones de etanol. Preferentemente fresco 30%, 50%, 70% de etanol en el hielo antes de su uso.

Solución de tinción:

1% de toluidina y azul en el 1% bórax.

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
	Suave	Duro
Una resina	54g	50g
Endurecedor B	44.5g	50g
Acelerador de C	2.5g	1.75g
Plastificante D	10g	0,75 g

Tabla 1. Resina de preparación

Para preparar la resina, con cuidado, pero mezcle todos los ingredientes en un vaso de plástico con un agitador magnético con una barra de agitación general. Evitar las burbujas. Después de alícuota de la mezcla, en viales de centelleo estándar o recipientes similares y congelar a -20 ° C. El uso de resina suave para todas las aplicaciones a menos que su instalación de EM pide la formulación más difícil. Use guantes para manipular la resina (cancerígenos en su forma polimerizada). Para polimerizar la resina en el equipo y los desechos, cocer al horno a 70 ° C durante la noche. Después, el desecho puede ser descartado con seguridad y equipos de limpiar y reutilizar. Resina derramada no polimerizado se puede limpiar con isopropanol.

Reactivo	Proveedor	Número de catálogo
Volar pad	por ejemplo, Genesee	59-119
Glutaraldehído	Sigma	G7526-10 X 10 ML
OsO4	Polysciences, Inc.	0972A-20
Óxido de propileno	Pescador	04332-1
Bisturí se encarga, por # 3	Pescador	22080046
Hojas de bisturí # 11	Pescador	08 a 916-5B
Pipetas de transferencia	Pescador	13-711-7M
Durcupan (R) ACM resina	Sigma (Fluka)	44610-1EA
De acero de disección aguja	Pescador	S17346
BEEM molde incorporación de planos	Microscopía Electrónica de Ciencia.	70904-12
Teflon hojas de afeitar recubierto	Microscopía Electrónica de Ciencia.	71970
Q-tip (hisopos estériles)	Pescador	14-959-81
Portaobjetos de vidrio	Pescador	12-550-143
Cubreobjetos n º 1, 22X60 mm	Pescador	12-531k
Gelatina	Pescador	ICN96010280
Cr (III) K SO 4 dodecahidrato	Sigma	243361
Diamante Histo cuchillo, 6mm	Diatome EE.UU.	60-Su
Azul de toluidina O	Pescador	BP107-10
El bórax (Na-tetraborato)	Pescador	AC20629-1000
DPX medio de montaje	Sigma	44.581-100ML

Tabla 2. Materiales