De proteínas de membrana de superposición de ensayo: Un protocolo de prueba de interacción entre las proteínas soluble e insoluble In vitro</em

Resumen

Pruebas de interacción proteína-proteína es indispensable para la disección de la funcionalidad de las proteínas. Aquí, presentamos un In vitro Proteína-proteína ensayo de unión a la sonda una membrana de proteína inmovilizada con una proteína soluble. Este ensayo proporciona un método fiable para comprobar la interacción entre una proteína insoluble y de una proteína en una solución.

Resumen

Las interacciones entre las proteínas de la validación de diferentes es de vital importancia para la investigación de sus funciones biológicas a nivel molecular. Hay varios métodos, tanto in vitro como in vivo, para evaluar la unión a proteínas, y por lo menos dos métodos que complementen las carencias de cada uno debe realizar para obtener conocimientos fiables.

Para un ensayo in vivo, la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) ensayo representa el enfoque más popular y menos invasivo que permite detectar interacción proteína-proteína en las células vivas, así como identificar la localización intracelular de las proteínas que interactúan ^1,2. En este ensayo, no fluorescente mitades N-y C-terminal de la GFP y sus variantes están fusionados a las proteínas de prueba, y cuando las dos proteínas de fusión se unen debido a las interacciones de las proteínas a prueba, la señal fluorescente se reconstituye ^3-6 . Debido a que su señal es fácilmente detectable por microscopía confocal de epifluorescencia o, BiFC se ha convertido en una poderosa herramienta de elección entre los biólogos celulares para el estudio de las interacciones proteína-proteína en ^tres células vivas. Este ensayo, sin embargo, a veces puede producir resultados falsos positivos. Por ejemplo, la señal fluorescente se puede reconstituir dos fragmentos de las buenas prácticas agrarias dispuestas hasta 7 nm de cada uno de otro por cerca de embalaje en un compartimiento subcelular pequeña, más bien que debido a las interacciones específicas ^7.

Debido a estas limitaciones, los resultados obtenidos de las tecnologías de células en vivo de imágenes deben ser confirmados por un enfoque independiente sobre la base de un principio diferente para la detección de interacciones entre proteínas. Co-inmunoprecipitación (Co-IP) o el glutatión transferasa (GST) pull-down ensayos representan tales métodos alternativos que se utilizan comúnmente para analizar interacciones proteína-proteína in vitro. Sin embargo, eEn estos ensayos, sin embargo, las proteínas de las pruebas debe ser fácilmente soluble en el búfer que supportsused para la reacción de unión. Por lo tanto, las interacciones específicas que implican una proteína insoluble no puede ser evaluado por estas técnicas.

Aquí, se expone el protocolo para el análisis de la proteína de membrana superpuesta vinculante, lo que evita este problema. En esta técnica, la interacción entre las proteínas solubles e insolubles puede ser fiable a prueba, porque una de las proteínas es inmovilizado en una matriz de membrana. Este método, en combinación con los experimentos in vivo, tales como BiFC, ofrece un método fiable para investigar y caracterizar las interacciones entre las proteínas fielmente soluble e insoluble. En este artículo, la unión entre el virus del mosaico del tabaco (TMV) proteína de movimiento (MP), que ejerce múltiples funciones viral en la célula a célula de transporte ^8.14, y una planta de interactor identificado recientemente celular, el tabaco ankyrin repetir que contienen proteínas (ANK ) ^15, se demuestra mediante esta técnica.

Protocolo

1. Expresión y la extracción de las proteínas

1. Diferencialmente etiqueta de las proteínas de la prueba para su detección. Etiqueta de la proteína a ser inmovilizado en la membrana (ProIM) con una etiqueta de un tamaño más grande (por ejemplo, IVA), y la etiqueta no fusionados se puede utilizar como un control de inmovilizado negativo (ProIMnc). Etiqueta de la proteína a ser utilizado como una sonda soluble (PROSOL), ya sea con una grande o una pequeña etiqueta. Fusible de la misma etiqueta a un control adecuado de proteínas solubles en negativo (ProSOLnc) e incluir en el ensayo de interacción para confirmar la especificidad de la unión detectado.
2. ....

Discusión

Este enfoque es adecuado para las pruebas de interacciones proteína-proteína entre las combinaciones de las proteínas, cuando al menos uno de los cuales las proteínas se disuelve fácilmente en el tampón de unión, y se aplicó con éxito a otra combinación de proteínas ^17,18. El iInteractions entre las proteínas que son insolubles en estas condiciones no pueden ser probados por el presente Protocolo.

Además, el replegamiento de ProIM éxito es crítico para el ensayo. Enjuague la membr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Proteína kit de ensayo	Bio-Rad	500-0001
Proteinasa cóctel de inhibidores de	SIGMA	S8820
Mini-Protean sistema	Bio-Rad	165-8000
Semi-seco Western Blot SD electrotransferencia sistema	Bio-Rad	170-3940
IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano de anticuerpos	GenScript	A00098
Anti-GST anticuerpo policlonal de conejo	GenScript	A00097
Anti-strepII	GenScript	A00626
Biotrace, nitrocelulosa NT membrana de transferencia	Pall Científico	27377-000
Immobilon occidental HRP sustrato quimioluminiscente	Millipore	WBKL S0 050