Los procedimientos con animales descritos aquí se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Departamento de Recursos de Animales de Laboratorio, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nueva York.
NOTA: Los ratones machos que se van a diseccionar para aislar próstatas o tumores de próstata para la generación de organoides deben haber alcanzado al menos la edad de madurez sexual, alrededor de las 8-10 semanas de edad. Las edades específicas de los ratones pueden variar según los estudios. Algunos factores a tener en cuenta al elegir la edad incluyen cambios dependientes de la edad en las poblaciones de células prostáticas, la expresión dependiente de la edad de transgenes Cre impulsados por promotores específicos y la tasa de progresión del tumor de próstata en un GEMM en particular.
NOTA: La Figura 1 muestra una descripción gráfica del procedimiento para la generación de organoides tumorales.
1. Preparación
- Prepare medios de organoides prostáticos de ratón de acuerdo con Drost et al. con las siguientes alteraciones. Utilice medio condicionado en lugar de proteínas recombinantes para Noggin y R-Spondin y utilice una concentración final de 1% (v/v), en lugar de 10%, para los medios condicionados con Noggin y R-Spondin.
NOTA: Las células HEK293 transfectadas de forma estable con Noggin-Fc de ratón HA o Rspo1-Fc de ratón HA se utilizan para producir medio acondicionado con Noggin o R-Spondin, respectivamente. Estas líneas celulares fueron un regalo del Laboratorio Calvin Kuo de la Universidad de Stanford.
- Prepare la solución de digestión en un tubo de 15 mL diluyendo 20 mg/mL de colagenasa II con medios DMEM/F12(+++) avanzados hasta una concentración final de 5 mg/mL. Añadir Y-27632 Inhibidor de rocas a la solución de colagenasa II a una concentración final de 10 μM.
NOTA: La proporción de tampón de digestión a tejido es de 1 mL a 50 mg, que utilizamos según Drost et al.
2. Picadura y digestión de tejido tumoral
- En la campana de cultivo celular, coloque el tejido tumoral de próstata en una placa de cultivo estéril de 10 cm, diseccione y deseche el tejido necrótico.
- Picar el tejido tumoral de próstata restante en cubos de 1 mmy 3 sujetando los trozos de tejido con las pinzas curvas estériles y cortando con unas tijeras de disección.
- Coloque los trozos de tumor picados en el tubo de 15 ml con el tampón de digestión recogiéndolos con el lado curvo de las pinzas. Digiera el tejido tumoral a 37 °C agitando durante 1,5 a 2 h. Verifique el progreso de la digestión cada 20 min.
NOTA: En este momento, saque al menos 2 mL de matriz de almacenamiento a -20 °C y descongele en hielo. Las alícuotas de 1 mL de matriz tardarán aproximadamente 3 h en descongelarse.
- Después de la digestión del tejido, centrifugar el tubo a 175 x g durante 5 minutos a 4 °C para formar una pastilla celular.
- Retire el sobrenadante, agite el tubo para aflojar el gránulo de célula y vuelva a suspender el gránulo de célula en 1 ml de tripsina precalentada suplementada con 10 μM de inhibidor de rocas Y-27632. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
- Después de la incubación, pipetee hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una punta P1000 estándar. Vuelva a colocar el tubo a 37 °C en baño de agua durante otros 5 minutos y repita el paso 2.6.
NOTA: En este momento del procedimiento, caliente una placa de cultivo celular estéril de 6 pocillos colocándola en una incubadora a 55 °C.
3. Conteo de células y resuspensión en matriz
- Lave las células añadiendo 9 mL de AdDMEM/F12(+++) frío y centrifugue el tubo a 175 x g durante 5 min a 4 °C.
- Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, agite el tubo para aflojar el pellet y vuelva a lavar las células agregando 10 ml de AdDMEM/F12 frío (+++). Centrifugar el tubo a 175 x g durante 5 min a 4 °C.
- Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, mueva el tubo para aflojar el pellet, vuelva a suspender las células en 1 ml de AdDMEM/F12 (+++) y cuente el número de células con un hemocitómetro de acuerdo con el procedimiento estándar.
- De siete a ocho cúpulas caben en un pocillo de un plato de 6 pocillos cuando los organoides se colocan en matriz gota a gota. Aproximadamente 200 μL de matriz producirán 7-8 cúpulas. Decida cuántos pocillos de organoides se necesitan para futuros fines experimentales y calcule el volumen de matriz requerido. A continuación, calcule el volumen de solución que contiene células necesario para tener una concentración final de 1,0 x 106 células/mL de matriz.
- Después de contar las células, centrifugar a 175 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante, agite el tubo para aflojar el gránulo y vuelva a suspender las células en el volumen de la matriz calculado en el paso 3.4.
NOTA: La matriz permanece en forma líquida solo a 4 °C; Mantenga los tubos de material de matriz y las soluciones de celda de matriz en hielo en todo momento.
4. Domos de matriz de recubrimiento y aplicación de medios
- Mezcle la solución de matriz celular con una pipeta P200 para distribuir uniformemente las celdas sin introducir burbujas. Retire la placa de cultivo de 6 pocillos de la incubadora a 55 °C.
- Pipetee con cuidado 200 μL de solución de células de matriz y deje caer rápidamente la solución en un pozo para crear cúpulas.
- Repita el paso 4.2. hasta que se agote el volumen de la solución de celda matriz. Deje que los domos se solidifiquen a temperatura ambiente durante 2 minutos.
- Dé la vuelta a la placa de 6 pocillos y colóquela en una incubadora a 37 °C para continuar la solidificación durante 20 minutos.
- Después de la incubación, agregue 2 mL de medio organoide prostático de ratón a cada pocillo. Agregue el andrógeno sintético R1881 a cada pocillo para una concentración final de 1 nM y el inhibidor de rocas Y-27632 a una concentración final de 10 μM. Mezcle cuidadosamente y coloque la placa en una incubadora a 37 °C para el cultivo.
NOTA: Los medios de cultivo de organoides deben complementarse con 10 μM de inhibidor de rocas Y-27632 durante solo 1 semana después de la generación del organoide.
