Perfusión hepática murina in vivo: un método para infundir el hígado de roedor con solución a través de la vena porta

Resumen

Fuente: Cabral, F., et al. Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales a partir de la perfusión hepática de ratón. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe un procedimiento para la perfusión del hígado de ratón a través de la vena porta utilizando una solución de colagenasa antes de aislar las células hepáticas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación

1. Preparación de soluciones y medios de cultivo
   1. Prepare todos los medios de cultivo y la zona de amortiguación de acuerdo con la Tabla de Materiales.
2. Preparación de instrumentos
   1. Instale un baño de agua (>10 L) a 42 °C, una bomba peristáltica de velocidad variable y pinzas para sujetar los frascos. Prepare las tijeras curvas y las pinzas (Figura 1).
   2. Sobre o adyacente al baño de agua, coloque una bandeja para hornear (aproximadamente 38 x 26 cm) con una almohadilla de espuma de poliestireno (rejilla cónica de 50 mL), superpuesta con una almohadilla absorbente cortada en una pieza de 20 x 20 cm (Figura 1).
   3. Coloca un trozo de cinta adhesiva (de 5 a 8 cm) cerca. Coloque cerca un hilo de coser de poliéster de 20 cm que esté cortado y listo para usar. Obtenga un catéter de plástico con una aguja retráctil (7 mm x 19 mm, Figura 1).
3. Preparación de la cristalería
   1. Con pinzas, coloque e inmovilice un matraz de 1 L en el baño de agua que contenga 200 mL de 1x PBS con un tapón que tenga dos pipetas de 1 mL que entren en la solución. El corcho de goma tiene muescas para permitir la recirculación del fluido en un circuito cerrado.
   2. Con otra pinza, coloque un matraz de 125 mL que contenga 45 mL de tampón 2 junto con un tapón que tenga dos pipetas de 1 mL, una de las cuales está en el líquido cerca del fondo del matraz y la otra que permanece por encima del líquido y sopla oxígeno en el matraz><. nota: Cada pipeta en los tapones tendrá un adaptador de desconexión rápida conectado al extremo para facilitar el cambio del tubo. El oxígeno fluirá suavemente hacia ambos matraces a través de la pipeta en el tapón que no está sumergido en el líquido.
   3. Ponga a un lado dos platos de cristalización estériles.

>2. Procedimiento Animal

1. Calentar las soluciones de PBS y tampón 2 a 42 °C en el baño de agua y hacer circular el PBS durante al menos 20 mL/min en el tubo en un circuito cerrado para mantener calientes las líneas de líquido. Sumerja el exceso de tubo en el baño de agua para que permanezca lo más cerca posible de 42 °C. Drene el extremo macho del tubo en el matraz de 1 L que contiene PBS.
2. Coloque una bola de algodón en la almohadilla absorbente y agregue aproximadamente 2 mL de isoflurano al 30% (compuesto por polietilenglicol 200 que disminuye la tasa de evaporación del isoflurano) sobre la bola de algodón usando una pipeta de transferencia.
3. Levante al ratón por la cola, colóquelo en uno de los platos de cristalización y luego volque rápidamente el plato sobre la bola de algodón para que el ratón tenga un pequeño espacio en el que inhalar la anestesia. Observe la frecuencia respiratoria del ratón y asegúrese de que el ratón esté efectivamente bajo anestesia.
   nota: La frecuencia respiratoria debe ser más lenta y profunda, la cola flácida y las patas no responden a la prueba de pinzamiento bajo anestesia; consulte las pautas de IACUC para obtener detalles adicionales.
4. Mientras el ratón está bajo anestesia (esto tarda de 1 a 2 minutos), prepare el cilindro de una jeringa de 10 ml sacando el émbolo e insertando una pequeña bola de algodón. Agregue 1-2 ml de isoflurano al 30% con una pipeta de transferencia a la bola de algodón dentro del barril y coloque el barril con el extremo abierto hacia abajo sobre una mesa mientras espera que el ratón pierda el conocimiento.
5. Retire rápidamente el plato de cristalización, voltee el mouse sobre su espalda y coloque el cilindro de la jeringa sobre su nariz. Verifique dos veces la frecuencia respiratoria, el pellizco de los dedos del pie y la cola flácida. Cualquier respuesta al pellizco del dedo del pie y la cola flácida indica que el ratón no está completamente bajo anestesia. Mantenga el cilindro de la jeringa sobre el hocico para mantener la inconsciencia.
6. Coloque tachuelas a través de las patas del ratón, con las extremidades extendidas en posición supina. Humedecer el abdomen y la caja torácica con isopropanol al 70% o etanol.
7. Con las pinzas rectas en una mano, levante la piel cerca de la base del abdomen. Con unas tijeras en la otra mano, corte la piel y el peritoneo. La incisión debe ser horizontal o a través de la base de la piel de la carpa. Asegúrese de cortar todas las capas de la piel y el peritoneo para acceder al intestino. Corte lateralmente alrededor del abdomen hasta la caja torácica en ambos lados sin cortar ninguno de los órganos.
8. Corta el colgajo de piel cortando a través de la caja torácica inferior. Mueva los intestinos hacia la derecha con la parte posterior de las pinzas para exponer la vena porta.
   nota: El sangrado del animal debe ser mínimo; El animal debe seguir respirando y bajo anestesia profunda.
9. Coloque las pinzas curvas cerradas debajo de la vena porta entre el hígado y la vena pancreaticoduodenal superior (flecha de la Figura 2).
10. Abra las pinzas mientras está debajo de la vena porta. Agarra el hilo y tira de él con cuidado para que quede centrado debajo de la vena porta. Haz un nudo simple alrededor de la vena porta sin ceñirla.
11. Coloque las pinzas curvas debajo de la vena porta y tire suavemente de ellas hacia la cola del ratón para enderezar la vena (Figura 3A).
12. Con el catéter en la otra mano, coloque el bisel de la aguja boca arriba y paralelo a la parte inferior de la vena porta cerca de las pinzas (Figura 3B).
13. Perfore suavemente la vena con la aguja (Figura 3C). Asegúrese de que el bisel de la aguja esté en el lumen de la vena. Retraiga la aguja con resorte y continúe empujando el catéter de polímero a través de la vena hasta que el bisel esté cerca del área ramificada venosa. Esto se encuentra dentro del hígado. Si el catéter se coloca correctamente, será visible un reflujo de sangre. (Figura 3D).
14. Apriete el nudo simple y tire de él hacia abajo en el catéter para ayudar a estabilizarlo. Reduzca inmediatamente la velocidad de la bomba de 20 mL/min a 4 mL/min y corte otro vaso sanguíneo importante para el drenaje. Corta la aorta abdominal para obtener resultados óptimos.
15. Coloque el extremo macho del tubo en el extremo hembra del catéter (Figura 4A). Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la línea. Tenga cuidado de que el catéter no se introduzca en el hígado ni se salga de la vena. La colocación de la rosca no es esencial, aunque ayuda a prevenir el reflujo fuera de la vena y ayuda a mantener el catéter en la posición correcta (Figura 4B, C).
16. Use cinta adhesiva para inmovilizar el tubo en la almohadilla inferior. Use las pinzas rectas para apretar el vaso sanguíneo efluente e inflar el hígado unas cuantas veces para asegurarse de que toda la sangre se haya drenado (Figura 4D).
    nota: Es posible que la cinta de laboratorio estándar no funcione; Sin embargo, la cinta adhesiva permanecerá adherida a la almohadilla, incluso en condiciones húmedas.

3. Perfusión hepática

1. Mientras el hígado se lava con PBS, mida aproximadamente 24 mg de colagenasa tipo IV y colóquelo en el matraz que contiene 45 ml de tampón 2 en el baño de agua. Asegúrese de agitar el líquido en el matraz para que la colagenasa se disuelva por completo y vuelva a colocar el matraz en la abrazadera de modo que la parte líquida que contiene el matraz quede completamente sumergida en el agua.
2. Observe el cambio de color del hígado a medida que se enjuaga con PBS. Cambie el tubo de salida del matraz de 1 L al matraz de 125 mL. No permita que las burbujas de aire fluyan hacia el hígado.
3. Una vez que el tampón de perfusión llegue al hígado, apriete brevemente el vaso sanguíneo efluente para acumular algo de presión dentro del vaso y permitir que este líquido llene todos los lóbulos del hígado. Asegúrese de no cortar el drenaje por mucho tiempo, ya que eso puede reventar el delgado tejido conectivo que rodea el hígado (cápsula de Glisson) y destruir la perfusión o el flujo de líquido dentro del lecho capilar del hígado.
4. Permita que el tampón 2 con colagenasa se filtre a través del hígado hasta que los 45 ml hayan fluido a través del tejido><. nota: Si tiene éxito, la cápsula de Glisson debe separarse del parénquima o del tejido hepático y el hígado mismo debe parecer amorfo.
5. Agregue aproximadamente 10 mL de Tampón 1 al otro plato de cristalización y colóquelo junto al ratón.
6. Retire el catéter y apague la bomba.
7. Con las pinzas rectas y las tijeras, corte el hígado del ratón. Si la digestión de la colagenasa fue muy eficiente, puede ser necesario tener a mano una cuchara limpia y estéril para extraer el hígado del ratón y colocarlo en el tampón 1.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática de la sala de perfusión. Los matraces se mantienen en su lugar mediante abrazaderas (no se muestran); el tubo que contiene fluido se cambia del matraz de 1 L al matraz de 125 mL durante el procedimiento está representado por la línea de puntos roja. Tenga en cuenta que la alimentación de oxígeno no burbujea directamente en las soluciones de los mat...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraz Erlenmeyer de 1 L	Fisher Científico	S63274
Matraz Erlenmeyer de 250 mL	Fisher Científico	S63271
Tubo de silicona	Cole-Parmer	96400-14	Este tubo va desde los matraces a través de la bomba hasta el conector en T y luego hasta la jeringa de 1.0 mL que está conectada al catéter.
Tubos Tygon	Fisher Científico	R3603	Se utiliza como adaptador entre el 96400-14 y las pipetas y el conector T. También se puede utilizar para el tubo de oxígeno.
Conectores en T	Cole-Parmer	EW-06294-82
Desconexiones rápidas	Fisher Científico	6150-0010
Abrazaderas de pellizco	Fisher Científico	6165-0002
Bomba de velocidad variable Masterflex L/S; modelo 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	Bomba periplástica con velocidad variable
Cabezal de la bomba; modelo 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
Pipetas graduadas de vidrio de 1,0 mL	Fisher Científico	13-678
Tijeras curvas no dentadas	Herramientas de Bellas Ciencias	14069-12
Pinzas Dumont	Herramientas de Bellas Ciencias	11252-20
Pinzas curvas	Herramientas de Bellas Ciencias	13009-12
Jeringa de 10 mL	Fisher Científico	03-377-23	Solo se necesitará el cilindro de la jeringa
Cuchara esterilizada	Tienda de artículos para el hogar
Bolita(s) de algodón	Tienda de artículos para el hogar
Hilo de coser de poliéster	Tienda de artículos para el hogar
Cinta adhesiva	Tienda de artículos para el hogar
Tachuelas para el pulgar	Tienda de artículos para el hogar
Almohadilla de espuma de poliestireno	Gradilla cónica de 50 mL
Bandeja para galletas/hornear	Tienda de artículos para el hogar
Almohadillas absorbentes	Fisher Científico	14-206-64
Baño de agua de 19 L	Fisher Científico	TSCOL19
Catéter intravenoso blindado BD Insyte Autogaurd calibre 24	Becton Dickinson	381412	Catéter de plástico con aguja retráctil
Platos de cristalización 100x50	VWR	89000-290
Placas de poliestireno y Petri	Sigma Aldrich	P5481-500EA
Tubos cónicos de 50 mL	Fisher Científico	12-565-270
Pipetas graduadas (5 mL)	Fisher Científico	170355
Pipetas graduadas (25 mL)	Fisher Científico	170357
EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	542000	Filtro de 100 μm
EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	542040	Filtro de 40 μm
Reactivos
nombre	compuesto	Gramos (g/L)	Milimolar (mM)
Tampón 1; pH 7.4	NaCl	8.3	Artículo 142
	Kcl	0.5	6.7
	HEPES	2.4	10
	Bsa	15	0,226
Tampón 2; pH 7.4	NaCl	3.9	66.74
	Kcl	0.5	6.71
	CaCl2	0.7	6.31
	HEPES	24	100
	Bsa	15	0,226
	Rojo de fenol	0.01	0.03
PBS; pH 7.4	NaCl	8	Artículo 137
Kcl	0.2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0.2	1.4
OTROS REACTIVOS
nombre	compañía	Número de catálogo	Comentarios
Colagenasa tipo IV	Sigma Aldrich	C5138
Isoflurano	Abcam	AB144581