Diana funcionalizada de nanopartículas para el cáncer de ovario: una técnica para facilitar la absorción del agente de contraste de nanopartículas conjugadas con ácido fólico por las células de cáncer de ovario

Resumen

Fuente: Lusk, J. F. et al. Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústica. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos una técnica para facilitar la internalización de nanopartículas de sulfuro de cobre cubiertas de ácido fólico (CuS NPs). Las NP de CuS funcionalizadas con ácido fólico tienen la capacidad de dirigirse a los receptores de folato que están sobreexpresados en muchas células de cáncer de ovario.

Protocolo

1. Síntesis y funcionalización de nanopartículas

>PRECAUCIÓN: Toda síntesis debe realizarse en una campana de gases químicos ventilada.

1. Antes de la síntesis, filtre aproximadamente 300 mL de agua desionizada (DI) a través de un filtro estéril de 0,2 μm.
2. Limpie un matraz de vidrio de fondo redondo de 250 ml con una solución de detergente y enjuague con agua desionizada. Agregue 0,0134 g de CuCl₂ en 100 ml de agua desionizada para crear una solución de 1 mM.
3. Agregue 0,015 g de ácido fólico (FA) a la solución de CuCl₂ y revuelva durante ~ 5 minutos con una barra de agitación magnética.
4. Añada Na₂S·9H₂O (0,024 g en 100 μL de agua DI) durante aproximadamente 10 s a la mezcla de reacción utilizando una pipeta de 200 μL.
   nota: Tras la adición de Na₂S·9H₂O, la solución cambiará de color de un amarillo claro a un marrón oscuro.
5. Tape la reacción y colóquela en un baño de aceite, a 90 °C, y continúe agitando con una barra de agitación magnética. Después de aproximadamente 15 minutos, o cuando el baño de aceite haya alcanzado los 85-90 °C, deje que la reacción continúe durante una hora adicional. Su mezcla debe volverse gradualmente de un color verde oscuro.
   nota: Asegúrese de ventilar el sistema mientras calienta la mezcla de reacción para evitar la acumulación de presión.
6. Retire el recipiente de reacción del baño de aceite y enfríe brevemente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos antes de pasar a un baño de hielo.
7. Una vez que la mezcla de reacción se haya enfriado por debajo de 20 °C, ajuste el pH a 10 utilizando 1M NaOH para disolver el ácido fólico restante en la solución.
8. Purifique la mezcla de reacción FA-CuS utilizando una columna de centrifugación de 30 kDa. Agregue la solución en lotes de 15 mL a la columna y centrifugue a 3,082 x g durante 15 min.
9. Una vez concentrada toda la mezcla de reacción, recombine las fracciones concentradas y lave 4 veces con 15 mL de NaOH pH 10 en la columna de centrifugación de 30 kDa.
10. Para mediciones de masa, tome 1/3 de la solución (~66 μL) y divídala en tres viales de vidrio. Secar en horno de vacío durante la noche a 40 °C bajo un vacío de ~27 mmHg.
11. Disuelva los otros 2/3 de la solución concentrada en 250 μL de PBS y almacene a 4 °C hasta su uso posterior.
12. Antes de utilizar los NP FA-CuS, sonicélos durante 30 minutos en un sonicador de baño a temperatura alta.

2. Absorción de las NPs de FA-CuS por las células de cáncer de ovario

1. Antes de la incubación con NPs de FA-CuS, incubar las células SKOV-3 en un matraz T75 con 8-15 mL de medio RPMI-1640 sin ácido fólico con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina durante al menos 24 h.
2. Siembre las células en 0,5 mL de medio de crecimiento completo RPMI-1640 sin ácido fólico a una densidad de 0,1 x 10⁶ células/mL en una placa de 24 pocillos.
3. Al día siguiente, incubar las células con 400 μg/mL de FA-CuS NPS en 0,5 mL de medio de crecimiento completo RPMI-1640 sin ácido fólico durante 2 h.
4. Después de esta incubación, tripsinizar las células con 0,5 mL de tripsina al 0,25% con EDTA. Agregue al menos 1 mL de medio de crecimiento completo RPMI-1640 sin ácido fólico para neutralizar la tripsina y centrifugue las células a 123 x g durante 6 minutos.
5. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 2 mL de PBS y centrifugue a 123 x g durante 6 min. Realice este paso de lavado 2 veces para eliminar cualquier NP no unido.
6. Vuelva a suspender las células en 1-2 mL de PBS con solución de Tween al 2%.
7. Cuente las células con un hemocitómetro y azul de tripán. Además, diluya las células si los recuentos de células son demasiado altos. Diluir las células en PBS con 2% de interpolación hasta la concentración elegida para la detección.
8. Las celdas ya están listas para ser analizadas por el sistema PAFC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,025% de tripsina con EDTA	Corning	25-053-CL
Filtros centrífugos Amicon Ultra-15	Millipore	UFC903024
Filtros centrífugos Amicon Ultra-4	Millipore	UFC803024
Hematocitómetro de línea brillante	Hausser Científico	Año 1492
Cloruro de cobre (II)	ACROS ORGANICS	206532500
Baño de limpieza ultrasónico digital de la serie CPX	Marca Pescadora	Modelo CPX3800
Jeringas Norm-Ject de 10 mL	LOBO HENKE SASS	4100-X00V0
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
ácido fólico	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Pbs	Alfa Aesar	J62036
Penicilina Estreptomicina	GIBCO	Números 15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) Sin ácido fólico	Gibco	27016-021
Células SKOV-3	ATCC	HTB-77
Perlas de hidróxido de sodio	BDH	BDH9292-500G
Sulfuro de sodio no hidratado	Sigma-Aldrich	431648-50G
Solución de Azul de Tripán 0.4%	Amresco	K940-100ML
Filtro de jeringa estéril de 0,2 μm	VWR	28145-477
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	Detergente utilizado para la limpieza de cristalería.
Preadolescente 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML