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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
>1. Preparación de mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario humano
Para este protocolo se utilizaron muestras de tejido ovárico, incluyendo tejidos de cáncer de ovario (n = 7).
- Prepare 250 mM del tampón de aislamiento mitocondrial mezclando 210 mM de manitol, 70 mM de sacarosa, 100 mM de cloruro de potasio (KCl), 50 mM de Tris-HCl, 1 mM de ácido tetraacético diamino (EDTA), 0,1 mM de etilenglicol bis(2-aminoethil éter)ácido tetraacético (EGTA), 1 mM de inhibidor de la proteasa de fenilmetanosulfonilo (PMSF), 2 mM de ortovanadato de sodio (V) y 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,4.
- Coloque ~ 1,5 g de tejidos de cáncer de ovario en un plato de vidrio limpio.
- Agregue 2 mL del tampón de aislamiento mitocondrial preenfriado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido 3 veces.
- Use unas tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en trozos de aproximadamente 1 mm y3 m, y transfiera los tejidos picados a un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Añadir 13,5 mL de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga 0,2 mg/mL de nagarse, y luego utilizar un homogeneizador eléctrico para homogeneizar (utilizar escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) los tejidos picados (2 min, 4 °C).
- Añadir otros 3 mL de tampón de aislamiento mitocondrial a los homogeneizados de tejido y mezclarlos bien mediante pipeteo.
- Centrifugar el homogeneizado del tejido preparado (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Retire la fracción nuclear cruda (es decir, el pellet) y conserve el sobrenadante.
- Volver a centrifugar el sobrenadante (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Retire los microsomas (es decir, el sobrenadante) y conserve la pellet.
- Agregue 2 mL de tampón de aislamiento mitocondrial y vuelva a suspender bien el pellet mediante un pipeteo ligero.
- Centrifugar la suspensión de pellets (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Deseche el sobrenadante y conserve las mitocondrias crudas (es decir, el pellet).
- Agregue 12 mL de medio de gradiente de densidad al 25% (es decir, Nycodenz) para resuspender las mitocondrias crudas extraídas.
- Realice un gradiente de densidad discontinuo llenando un tubo de abajo hacia arriba con 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (que contiene las mitocondrias crudas del paso 1.11), 8 mL de 23% y 3 mL de medio de gradiente de densidad del 20%, y centrifugue (52,000 x g, 90 min, 4 °C).
- Use una jeringa larga y roma para recolectar las mitocondrias purificadas en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad del 25% y el 30% en un tubo limpio.
- Agregue tampón de aislamiento mitocondrial a las mitocondrias recolectadas para diluirlas hasta un volumen tres veces. Centrifugar (15.000 x g, 20 min, 4 °C) y desechar el sobrenadante.
- Añadir 2 mL de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender el pellet y la centrífuga (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Deseche el sobrenadante y guarde la bolita.
- Recoja el pellet final (es decir, las mitocondrias purificadas) y guárdelo a -20 °C.
nota: Combine todas las mitocondrias purificadas del tejido de cáncer de ovario como la muestra de mitocondrias para el análisis proteómico cuantitativo.