Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Creación de una línea celular VX2 in vitro
- Extraiga el tumor VX2 del músculo cuádriceps de conejo y el crecimiento en el flanco del ratón.
- Descongele los bloques tumorales VX2 congelados (1 cm x 1 cm), píquelos en una placa de cultivo con una cuchilla de bisturí y cuele a través de un filtro de 70 μm agregando pequeñas cantidades de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) secuencialmente para asegurarse de que todas las células se filtren para obtener un volumen final de 1 mL.
- Cuente las células y diluya con solución salina tamponada con fosfato al 0,9% hasta una concentración de 1 x 107/mL y colóquelas en hielo en un tubo estéril.
nota: Los bloques tumorales se obtuvieron de un colaborador de laboratorio a partir de la propagación previa de tumores VX2 en músculos del cuádriceps de conejo.
- Anestesiar una coneja blanca de Nueva Zelanda (peso 2,5-3,5 kg) con isoflurano inhalado al 2-5%, quitar el pelaje que recubre el lugar de la inyección y limpiar el lugar de la inyección con una solución de povidona yodada. Inyecte 500 μL de la suspensión celular VX2 preparada (5 x 106 células/mL) en el músculo cuádriceps del conejo. Monitoree clínicamente al conejo para detectar el crecimiento tumoral a partir del día 10.
- Sacrificar a los conejos después de que los tumores alcancen 1-1,5 cm de diámetro (medido externamente con calibradores) utilizando un método aprobado por el veterinario. Confirme la eutanasia mediante el control de los signos vitales, incluida la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria. Extirpar el tumor con instrumentos estériles después de limpiar el área con una solución de betadine.
- En un gabinete de seguridad biológica con instrumentos estériles, pique el tumor en trozos pequeños (0,2 cm) en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm con una hoja de bisturí. Pase los fragmentos tumorales a través de un filtro de células de 70 μm utilizando 1 mL de HBSS como se describe en el paso 1.1.1. Cuente las células y diluya con una solución salina al 0,9% para obtener 7,5 x 105 células en 200 μL.
- Anestesiar ratones machos NOD SCID gamma (peso 25 g) con isoflurano al 4% a 1 L/min y mantener la anestesia con isoflurano al 2%. Una vez que los ratones estén anestesiados, inyecte 200 μL de la solución del paso 1.1.5 en el tejido subcutáneo del flanco del ratón con una aguja de calibre 27.
- Recolección y paso de células VX2 in vitro
- Monitorizar clínicamente el crecimiento del xenoinjerto dos veces por semana hasta que los tumores alcancen 1 cm de diámetro mediante calibradores.
- Eutanasiar ratones colocándolos en una cámara de CO2 o realizando una luxación cervical después de la anestesia con gas isoflurano al 4%. Extirpar tumores en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica.
- Picar tumores con un bisturí en trozos de 1-2 mm en una placa de cultivo de tejidos de 6 cm que contiene 3 mL de medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham'ss F12+ 10% fetal bovine (FBS).
- Deje los fragmentos tumorales intactos en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante dos días hasta que las células comiencen a crecer a partir de los trozos tumorales. Posteriormente, revise diariamente las placas cultivadas por microscopía óptica para detectar la confluencia celular. Al alcanzar el 70% de confluencia, tripsinizar las células añadiendo 1 mL de tripsina al 0,05% al matraz y volver a colocarlas en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Neutralizar la tripsina con 6 mL de DMEM/Ham'ss F12 + 10% de medio FBS, recoger las células y centrifugar a 4 °C durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3,5 mL del nuevo medio DMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS. Siembra placas frescas de 6 cm recubiertas de colágeno I con 1,6 x 106 celdas por placa para lograr aproximadamente un 50% de densidad de siembra celular.
NOTA: La densidad de celdas del 50% se refiere a las celdas que ocupan el 50% de la superficie de la placa cuando están unidas.
- Pase temprano: Repita el proceso anterior (tripsinización, siembra) hasta que las células hayan pasado 5 veces y luego evalúe la pureza de la línea celular con PCR utilizando un ensayo de PCR cuantitativo para distinguir el ADN genómico del conejo del ADN genómico del ratón (ver paso 1.3.1-1.3.4).
nota: Después de 8 pasos, las células se pueden propagar en placas de cultivo de tejidos adherentes regulares no recubiertas de colágeno.
- Paso, tripsinización y congelación de alícuotas de células en DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO a una concentración de 2 x 106 por vial. Almacene las células en nitrógeno líquido hasta que sea necesario para los experimentos.
- Confirmación del origen de VX2 de las células supervivientes:
- Crear una cura estándar a partir de ADN genómico purificado de ratón y conejo (Paso 1.3.2 y Paso 1.3.3). Utilice cebadores que se dirijan a secuencias específicas de la especie dentro del segundo marco de lectura abierto del elemento retrotransposón LINE-1.
nota: Las secuencias de cebadores para CRPV E6 son: 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTG y 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Se utilizaron los elementos de retrotransposón LINE-1. Las secuencias de cebadores para el conejo LINE-1 son: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC y 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Las secuencias de cebadores para el ratón LINE-1 son: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG y 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- Para crear una curva estándar para CRPV E6, purifique el lisado de células tumorales VX2 (Paso 1.1.1) utilizando un kit comercial siguiendo el protocolo del fabricante. Cuantifique este ADN mediante un ensayo comercial. Realice 6 diluciones seriadas de 225 pg/μL a 0,925 pg/μL en tampón de EDTA-TE bajo. Para crear una curva estándar para el ADN genómico de ratón, diluya 100 μg de ADN genómico comercial de ratón en un tampón de EDTA-TE bajo en 5 diluciones desde 125 pg/μL hasta 0,0125 pg/μL.
- Coloque 4 μL de cada solución diluida de las muestras del paso 1.3.2 en pocillos y procese las muestras en un termociclador de PCR. Utilice los valores de Cq de cada corrida junto con las cantidades de ADN por pocillo para calcular una curva estándar utilizando la configuración de umbral automático del software del termociclador.
- Utilice los procedimientos estándar de qPCR para realizar PCR con 40 ciclos de ciclos de 2 pasos (98 °C y 60 °C) en un termociclador. Establezca valores umbral y establezca los valores delta Ct en >35 para garantizar que haya una contaminación mínima de ratones en la línea celular VX2 de conejo. El volumen total de cada reacción fue de 10 μL, consistiendo en 5 μL de 2x Mastermix, 1 μL de cebadores directos + inversos con concentración de cebador final en la reacción a 250 nM y 4 μL de muestra de ADN.
nota: Se establecen valores umbral y los valores delta Ct se establecen en >35 para garantizar que haya una contaminación mínima en ratones en la línea celular VX2 de conejo. El nivel recomendado de ADN VX2 para una detección fiable por qPCR es de 1 a 10 pg.
>2. Cultivo celular VX2 y creación de suspensión celular
- Descongele los viales que contengan células VX2 (congeladas en el paso 1.2.7) en un baño de agua a 37 °C durante 1 minuto y transfiera las células a un tubo de centrífuga cónico con 10 mL de medio de cultivo (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina). Centrifugar durante 8 min a 107 x g, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de celda en 9 mL de medio.
- Transfiera las células resuspendidas a un matraz de cultivo grande. Incubar las células sin agitar a 37 °C. Revise las células diariamente para detectar confluencias utilizando microscopía óptica y cambie los medios de cultivo cada tres días.
- Creación de suspensión de células VX2 cultivadas para inyección
- Tripsinizar las células añadiendo 3 mL de tripsina al 0,25% al matraz una vez que las células hayan alcanzado el 80% de confluencia. Coloque el matraz en la incubadora (37 °C) durante 5 min. Transfiera la solución a un tubo de centrífuga cónico y centrifuga durante 8 min a 107 x g y luego elimine el sobrenadante.
- Lave los gránulos de la celda 3 veces con 9 mL de solución salina tamponada con fosfato, centrifugue y elimine el sobrenadante como se indicó anteriormente. Cuente las células y diluya con solución salina tamponada con fosfato al 0,9% hasta una concentración de 4 x 107 células/ml y colóquelas en un tubo de centrífuga cónico estéril sobre hielo.
- Creación de suspensión de células VX2 propagadas in vivo para inyección
- Descongele los bloques tumorales VX2 congelados (1 cm x 1 cm), pique en una placa de cultivo con una cuchilla de bisturí y cuele a través de un filtro de 70 μm como en el paso 1.1.1. Agregue pequeñas cantidades de HBSS secuencialmente para asegurarse de que todas las células se filtren para un volumen final de 1 mL. Cuente las células y diluya con solución salina tamponada con fosfato al 0,9% hasta una concentración de 1 x107/mL y colóquela en hielo en un tubo estéril.
nota: Los bloques tumorales se obtuvieron de un colaborador de laboratorio a partir de la propagación previa de tumores VX2 en músculos del cuádriceps de conejo.
3. Establecimiento de Modelos Quirúrgicos
- Establecimiento de la anestesia quirúrgica y preparación preoperatoria
- Premedicar a las conejas blancas de Nueva Zelanda (2,5-3,5 kg) 1 h antes del procedimiento quirúrgico planificado con inyecciones de acepromazina (1 mg/kg IM) y meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anestesiar una coneja blanca de Nueva Zelanda (peso 2,5-3,5 kg) con isoflurano inhalado al 2-5%, quitar el pelaje que recubre el lugar de la inyección y limpiar el lugar de la inyección con una solución de povidona yodada.
- Intuble a los conejos anestesiados con una máscara laríngea (LMA) y asegúrelos con cinta adhesiva, manteniendo la anestesia profunda ajustando la dosis de isoflurano inhalado entre el 2 y el 5%. Controle la anestesia quirúrgica regularmente durante todo el procedimiento mediante el control de los signos vitales (frecuencia respiratoria, recarga capilar, saturación de oxígeno si está disponible) y el seguimiento de los signos que sugieren dolor (movimiento, retirada de estímulos, ruidos) o anestesia ligera (movimiento, masticación del tubo LMA)
nota: Esto debe ser realizado por alguien con experiencia en el monitoreo de la anestesia quirúrgica.
- Coloque un catéter de vena auricular de calibre 22 en la vena dorsal marginal. Administrar cefazolina (20 mg/kg) por vía intravenosa 10 min antes de la incisión quirúrgica en la piel.
- Corta el pelo sobre la pelvis y el abdomen antes de colocar al conejo en la mesa de operaciones, luego coloca a los conejos en posición dorsal en la mesa de operaciones. Limpie el campo quirúrgico con una preparación quirúrgica de la piel en 3 pasos (jabón de betadine, solución de clorhexidina, solución de betadine). Cubra el campo quirúrgico con paños de laparotomía después de marcar la parte superior del hueso púbico, dejando expuesta un área de 5 cm x 5 cm de la parte inferior del abdomen.
- Creación de la incisión de laparotomía e identificación de los cuernos uterinos
- Colóquese un gorro quirúrgico y una mascarilla. Frótese las manos con una solución quirúrgica de clorhexidina o betadine. Usando una técnica estéril, póngase una bata estéril y guantes quirúrgicos estériles.
- Con un bisturí # 11 hojas, haga una incisión de 2,5 cm de largo 1 cm craneal a la sínfisis del pubis a través de la piel y el tejido subcutáneo del abdomen del conejo. Incidir en el recto fascia y diseccionar los músculos rectos lateralmente para exponer el peritoneo subyacente. Ingrese al peritoneo bruscamente después de asegurarse de que la superficie inferior esté libre de intestinos u otros órganos abdominales.
- Localizar los cuernos uterinos identificando la vejiga urinaria y barrer con un dedo enguantado superior, posterior y lateralmente sobre el vértice de la vejiga><.
nota: Si es necesario, se puede vaciar la vejiga completa mediante presión digital. Una vez localizados, lleve los cuernos uterinos a través de la incisión abdominal para que descansen en la pared abdominal.
- Utilizando una sutura reabsorbible trenzada 3-0, realice una ligadura de sutura única de cada cuerno uterino aproximadamente 1,5-2,0 cm distal a las cervices. Coloque la sutura justo medial a las arterias uterinas, que corren a lo largo de la cara lateral de cada cuerno. Ate las suturas firmemente para ocluir los cuernos uterinos distales (Figura 1).
- Inoculación miometrial de VX2
- Con una aguja de calibre 27, inyecte 0,5 ml de la suspensión celular VX2 previamente preparada del paso 2.3.2 (para el modelo VX2 cultivado) o 2.4 (para el modelo VX2 propagado in vivo) en el miometrio de cada cuerno uterino proximal al sitio de sutura (entre el sitio de sutura y el cuello uterino). Inyecte durante 1 minuto y asegúrese de que no se inyecten células en la cavidad uterina subyacente. Anestesiar a los animales con isoflurano inhalado (2-5%) y una máquina anestésica con circuito Bain.
- Aplique presión en el sitio de inyección miometrial durante 30 segundos después de la inyección para minimizar la fuga de células. Inspeccione los sitios de inyección y sutura para ver si hay hemostasia y vuelva a colocar los cuernos uterinos en el abdomen.
- Cierre de la incisión quirúrgica
- Cierre profundo de la pared abdominal: identifique el ápice de la incisión peritoneal y agarre el peritoneo, el músculo recto y la fascia con pinzas de tejido.
- Para hacer esto, ancle la sutura en un vértice de la incisión suturando de superficial a profundo en un lado de la incisión y de profundo a superficial en el otro. Haz un nudo. Con la sutura adjunta, haga puntos perpendiculares a la incisión a través de las capas de la pared abdominal trabajando escalonadamente a lo largo de la incisión de lado a lado. Ata la sutura y corta.
- Cierre superficial de la pared abdominal: Identifique el ápice de la incisión cutánea y suture la piel abdominal mediante una sutura de polifilamento absorbible 3-0 subcuticular enterrada. Aplique pegamento quirúrgico a la incisión cerrada para oponerse a los bordes de la piel.
- Para hacer esto, ancle la sutura en un vértice de la incisión, suturando de profundo a superficial en un lado de la incisión y de superficial a profundo en el otro. Haz un nudo. Con las suturas adjuntas, haga puntos corridos en la capa dérmica paralelos a la incisión trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado. Ata la sutura y corta.
- Cuidados postoperatorios
- Despertar de la anestesia: Apague el isoflurano una vez que se cierre la incisión y deje que el conejo respire oxígeno con una máscara mientras monitorea los signos de despertar (p. ej., movimientos espontáneos, apertura de ojos y movimientos de masticación en las vías respiratorias de la máscara laríngea). Extubar al conejo una vez que se noten estos signos y proporcionar oxígeno con una máscara y una manta tibia hasta que los conejos estén alerta y puedan sentarse de forma independiente.
- Seguimiento postoperatorio: Monitorizar conejos dos veces al día durante 4 días y diariamente durante 10 días adicionales postoperatorios. Para monitorizar, evaluar su estado general, su ingesta de alimentos y agua, la diuresis y el gasto fecal, la evaluación del dolor, el peso, las constantes vitales (frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria) y su sitio quirúrgico en busca de hinchazón, eritema, secreción o dehiscencia.
- Control del dolor postoperatorio: Administrar Meloxicam diariamente (0,2 mg/kg de m²) durante 48 h en el postoperatorio y luego, según sea necesario, en función de la evaluación del dolor. Administrar buprenorfina inmediatamente después de la operación y cada 12 h (0,01-0,05 mg/kg de m²) durante 24 h y luego según sea necesario en función de la evaluación del dolor
- Los antibióticos (enrofloxacino 5 mg/kg IM) se pueden administrar diariamente durante siete días después de la operación para prevenir la infección de la herida según lo recomendado por su veterinario. Administrar líquidos subcutáneos (15 mL de SQ) dos veces al día según sea necesario para la deshidratación y se proporcionan alimentos blandos u otros suplementos dietéticos diariamente según sea necesario para la pérdida de peso.
