Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Montaje e incubación del portaobjetos tratado con ITO para cocultivos
- Cocultivos indivivisos
- Licuar la agarosa a 70 °C en una placa caliente.
- Coloque el divisor de 8 pocillos encima del portaobjetos tratado con tinóxido de indio (ITO) (Figura 1A). La parte inferior de goma del divisor ayuda a la adhesión a la corredera, pero asegúrese de aplicar una presión suave y continua hacia abajo durante el recubrimiento de agarosa para garantizar que no haya fugas ni mezclas entre los pocillos.
- Recoja las células en un tubo cónico de 15 mL, centrífugo (5 min a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en 1x medio DMEM. Si una densidad celular diferente es óptima, asegúrese de que en este paso la suspensión celular sea 2 veces la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, la densidad celular en este paso es de 50.000 células en 150 μL).
- Antes de sembrar el cultivo celular, agregue explante ovárico al centro del pocillo (Figura 1B).
- Agregue agarosa a cada cultivo celular en tubos individuales de 2 mL justo antes de la siembra. Para cada pocillo, combine 200 μL de suspensión celular y 200 μL de agarosa licuada en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, para cuatro pocillos, combine 800 μL de suspensión celular y 800 μL de agarosa al 2%. Quedará algo de mezcla, pero hacer un poco más de lo necesario evita burbujas de aire durante el pipeteo.
- Agregue agarosa a los cultivos celulares individuales inmediatamente antes de sembrar ese cultivo celular. La agarosa se enfriará en menos de un minuto, así que prepárese para emplatar rápidamente.
- Agregue inmediatamente 300 μL de la mezcla de celda / agarosa a cada pocillo (Figura 1C). La Figura 1C muestra tres condiciones celulares y una condición media, cada una con y sin ovario.
- Portaobjetos de incubación a 37 °C y 5% de CO₂ en una incubadora humidificada.
- Coculturas divididas
- Corte los divisores de plástico delgado y liso (Figura 2A).
nota: Este experimento utiliza los lados de un recipiente de medios desechables estériles porque son planos y delgados. Córtelos lo suficientemente anchos como para que quepan perfectamente en la hipotenusa del pozo (~ 13 mm).
- Licuar la agarosa a 70 °C en una placa caliente.
- Coloque el divisor de 8 pocillos en la parte superior del portaobjetos tratado con ITO (Figura 2B). La parte inferior de goma del divisor ayuda a la adhesión a la corredera, pero asegúrese de aplicar una presión suave y continua hacia abajo durante el recubrimiento de agarosa para garantizar que no haya fugas ni mezclas entre los pocillos.
2. Portaobjetos de secado y preparación para MALDI-TOF MS
- Después de cuatro días (o cualquier punto de tiempo preferido), retire el divisor de la cámara de los tapones de agarosa y del portaobjetos (Figura 1D). Separe suavemente los lados de la agarosa de la cámara con una espátula plana y tire suavemente de la cámara hacia arriba, teniendo cuidado de no mover ningún tapón de agarosa. Si se mueven, recolóquelos suavemente para que no se toquen entre sí.
- Coloque la corredera en un horno a 37 °C durante aproximadamente 4 horas, girando 90° cada hora.
nota: La rotación del portaobjetos es importante para garantizar una distribución uniforme del calor en toda la muestra.
- Una vez seco, retire el portaobjetos del horno (Figura 1E).
- Aplique la solución matricial utilizando el pulverizador (Figura 1F), con los siguientes parámetros: temperatura = 30 °C, caudal = 0,2 mL/min, número de pasadas = 8, dirección = CC y distancia de la boquilla = 40 mm.
nota: En lugar de un pulverizador de matriz, se puede utilizar un aerógrafo artístico para aplicar la matriz líquida. Se puede usar la misma solución de matriz para rociar, pero se requiere aproximadamente el doble de solución. Con el portaobjetos sujetado de modo que cuelgue verticalmente, rocíe el portaobjetos desde un ángulo de 90° aproximadamente a un pie de distancia hasta que la capa de la matriz sea visible.
- Añada 1 μL de calibrante (rojo de fósforo para objetivos de <500 Da, una mezcla de péptidos (consulte la tabla de materiales) para objetivos de <5.000 Da) para eliminar los puntos del portaobjetos. El rojo de fósforo no requiere mezcla con la matriz, pero la mezcla de péptidos requiere una mezcla 1:1 con la matriz para ayudar a la ionización. Espere a que el calibrador se seque.
- Dibuja una X con un rotulador permanente en cada esquina de la diapositiva y toma una imagen óptica con una cámara o un escáner a 1.200 ppp.
