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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Síntesis del núcleo de la nanoestrella dorada
NOTA: Las nanoestrellas de oro se utilizan como núcleos para ambos sabores de las nanosondas SERRS utilizadas en este experimento.
- Prepare 800 mL de solución de ácido ascórbico (C6H8O6) de 60 mM en agua desionizada (DI) y 8 mL de solución de 20 mM de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) en agua desionizada. Enfriar a 4 °C.
- Realice este paso de reacción a 4 °C. Coloque un matraz cónico que contenga 800 mL de la solución de ácido ascórbico en una placa de agitación magnética e induzca un vórtice constante. Agregue rápidamente 8 mL de la solución de ácido tetracloroáurico en el vórtice. En cuestión de segundos, se formarán nanoestrellas y la solución asumirá un color azul oscuro. Si el color en algún momento se vuelve rosado o púrpura, lo que significa la formación de nanoesferas, se debe descartar la suspensión y volver a intentar la síntesis.
- Vierta la suspensión de nanoestrellas en tubos cónicos de 50 ml y centrifugue durante 20 min (4 °C, 3.220 x g). Aspirar el sobrenadante dejando aproximadamente 200 μL de la solución en cada tubo. Preste atención a no alterar la bolita de nanopartículas en el fondo del tubo.
nota: El sobrenadante debe tener un tinte azul debido a las nanoestrellas suspendidas restantes.
- Con una micropipeta, agite la solución para suspender y recoger las nanopartículas de cada tubo. Es posible que parte del gránulo se compacte en la parte inferior del tubo y no se vuelva a suspender incluso con un pipeteo vigoroso: deseche esta parte.
- Transfiera la suspensión de nanopartículas a un casete de diálisis (MWCO 3,5 kDa) y dialice al menos tres días contra 2 L de agua desionizada, cambiando el agua diariamente. Almacene las nanoestrellas en diálisis a 4 °C durante un máximo de un mes con cambios de agua cada 3-4 días.
nota: Las nanoestrellas deben mantenerse en diálisis hasta que sea necesario para la reacción de silicación, como se describe en la sección 2.
>2. Formación de la capa de sílice
NOTA: Se sintetizan dos sabores de nanosondas Raman. El procedimiento de síntesis es el mismo para ambos, con la única diferencia de la molécula reportera Raman (colorante) utilizada. En este experimento se utilizan perclorato IR780 e IR140. La reacción siempre debe realizarse en recipientes de plástico. La síntesis es altamente escalable y se puede ajustar para la cantidad deseada de inyectado requerida. Aquí, se describe una síntesis de lotes medianos, que se puede escalar linealmente a volúmenes más bajos o más altos según sea necesario, con las mismas concentraciones y tiempos de reacción. Las reacciones para los dos tipos de nanosondas SERRS se pueden realizar en paralelo. Preste atención para evitar la contaminación cruzada. La sonicación debe realizarse para la redispersión de gránulos de nanopartículas después de la centrifugación, durante las etapas de lavado o después de que las nanopartículas se hayan almacenado durante más de una hora. La sonicación debe realizarse hasta que las nanopartículas estén claramente suspendidas en la solución, normalmente durante 1 s.
- En el tubo A (un tubo cónico de 50 mL), mezcle 10 mL de isopropanol, 500 μL de TEOS, 200 μL de agua desionizada y 60 μL de colorante (perclorato IR780 o IR140, 20 mM en DMF (dimetilformamida)).
- En el tubo B (un tubo cónico de 15 mL), mezcle 3 mL de etanol y 200 μL de hidróxido de amonio. Sonicar las nanoestrellas del Paso 1.4 para dispersar los cúmulos en solución y añadir 1,2 mL de nanoestrellas al tubo.
NOTA: la solución de hidróxido de amonio es altamente volátil y difícil de pipetear con precisión. Guárdelo a 4 °C, hasta que lo necesite, para facilitar el pipeteo.
- Coloque el tubo A en un mezclador de vórtice e induzca un vórtice constante. Agregue rápidamente el contenido del tubo B en el vórtice y siga mezclando durante unos 5 s. Transfiera inmediatamente a un agitador y deje que reaccione durante 15 minutos mientras agita a 300 rpm, a temperatura ambiente.
- Después de la incubación de 15 minutos, apague la reacción agregando etanol para llenar el tubo de 50 mL. Centrifugar durante 20 min a 3.220 x g y 4 °C.
- Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 0,5 mL de solución, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Añadir 1 mL de etanol y agitar con una pipeta para resuspender las nanopartículas. Transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 mL y lavar 4 veces con etanol centrifugando a 11.000 x g durante 4 min, aspirando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet por ultrasonidos durante aproximadamente 1 s.
- NOTA: En esta etapa, las nanopartículas silicatas pueden funcionalizarse, como se describe en la sección 3, o resuspenderse en agua desionizada con un paso de lavado adicional, para su almacenamiento a 4 °C durante un máximo de una semana.
>3. Funcionalización de superficies
NOTA: Las nanosondas IR780 SERRS se conjugarán con anticuerpos dirigidos al receptor de folato a través de un reticulante PEG para formar αFR-NPs; Las nanosondas de control IR140 SERRS se conjugarán con una monocapa PEG pasivante, para nt-NPs. Ambos sabores se forman a través de una reacción de tiol-maleimida en reacciones separadas pero paralelas.
- Lavar las nanopartículas dos veces centrifugando a 11.000 x g durante 4 min, aspirando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet en 1 mL de etanol por ultrasonidos. Repita el paso de lavado una vez más, pero vuelva a dispersar en 1 ml de etanol al 85 %, 10 % de 3-MPTMS (3-mercaptopropiltrimetoxisilano) y agua desionizada al 5 %. Incubar a temperatura ambiente durante 1-2 h para introducir tioles en la superficie de las partículas.
- Lavar las nanopartículas funcionalizadas con tiol centrifugando a 11.000 x g durante 4 min, aspirando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet por ultrasonidos, dos veces en etanol, dos veces en DI y, por último, en tampón HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico) (10 mM, pH 7,1), y reservar.
- NOTA: Se debe utilizar tampón MES (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico) o HEPES. Los tampones con mayor salinidad, como el PBS (solución salina tamponada con fosfato), pueden inducir la agregación de nanopartículas.
- Para los αFR-NPs funcionalizados con anticuerpos, reaccione 200 μg de anticuerpos (clon de anticuerpo de proteína de unión a folato [LK26]) con un exceso molar diez veces mayor de reticulante PEG (poli(etilenglicol)(N-hidroxisuccinimida 5-pentanoato) éter N'-(3-maleimidopropionil) aminoetano (CAS: 851040-94-3), en dimetilsulfóxido (DMSO)) en 500 μL de tampón MES (10 mM, pH 7,1) durante 30 min.
- Elimine el exceso de reticulante y concentrado de anticuerpos centrifugando la solución de anticuerpo-PEG en un filtro centrífugo (MWCO 100 kDa). Para los filtros centrífugos utilizados en este estudio, realizar la centrifugación durante 10 min a 14.000 x g y 23 °C. Recuperar los anticuerpos conjugados en un tubo nuevo invirtiendo el filtro y centrifugando a 1.000 x g durante 2 min.
- Pipetear las nanopartículas IR780 del paso 3.2 en el tubo con los anticuerpos y agitar con la pipeta para mezclar. Incubar la mezcla durante al menos 30 min a temperatura ambiente o a 4 °C durante la noche para formar los αFR-NPs.
- Para formar nt-NPs, añadir un 1% p/v de metoxi-terminaje (m)PEG5000-maleimida (CAS: 99126-64-4) disuelto en DMSO a las nanopartículas IR140 SERRS del paso 3.2 y dejar reaccionar en 500 μL de tampón MES (10 mM, pH 7,1) durante al menos 30 min a temperatura ambiente, o a 4 °C durante la noche.
- Para la administración a ratones (sección 4), centrifugar ambos sabores de nanosonda a 11.000 x g durante 4 min, aspirar el sobrenadante para eliminar la solución con anticuerpos libres/PEG no reaccionados, y redispersar cada sabor en tampón MES (10 mM, pH 7,1) a concentraciones de 600 pM. Al resuspender las nanopartículas, minimice la exposición innecesaria al ultrasonido para evitar la desnaturalización del anticuerpo.
>4. Inyección de nanosondas e imágenes
- Prepare las nanosondas (αFR-NPs y nt-NPs) como se describe en las secciones 1-3 y mezcle en una proporción de 1:1, para una concentración final de 300 pM de cada tipo en tampón MES (10 mM, pH 7,1). Opcionalmente, prepare patrones de referencia de 30 pM de cada uno de los sabores de la nanosonda en tubos cónicos pequeños (100 μL).
- Inyectar intraperitonealmente 1 mL de la suspensión de nanopartículas en cada ratón y masajear suavemente el vientre para distribuir las nanopartículas dentro de la cavidad peritoneal. Vuelva a colocar el ratón en su alojamiento. Después de 25 minutos o más, eutanasia al ratón mediante asfixia por CO2.
- Sujete el ratón a una plataforma quirúrgica, en posición supina (para la obtención de imágenes de todo el abdomen, la plataforma debe poder montarse en la platina del microscopio vertical).
- Con ayuda de pinzas dentadas y tijeras de disección, retire la piel para exponer el peritoneo y realice una gran incisión sagital (entre 2 y 3 cm de longitud) para exponer todo el abdomen. Coloque los colgajos peritoneales en la plataforma. Lave el interior de la cavidad peritoneal con al menos 60 mL de PBS utilizando un frasco de plástico.
NOTA: Para permitir la obtención de imágenes sin obstrucciones de todo el abdomen, es necesario movilizar o extirpar los intestinos. Para la escisión, se reseca con una ligadura de los vasos mesentéricos para reducir la hemorragia en la cavidad abdominal.
- Alternativamente, para obtener imágenes de órganos específicos, escríbalos después del lavado con PBS y colóquelos en un portaobjetos de microscopio.
- Transfiera la plataforma o el portaobjetos a un microespectrofotómetro Raman con configuración óptica vertical y una platina motorizada para la obtención de imágenes; utilice un sistema comercial con un láser de diodo de 300 mW y 785 nm, con una rejilla de 1.200 ranuras por mm, centrado a 1.115 cm-1.
- Concéntrese en el área de interés utilizando óptica de luz blanca, parafocal con el láser Raman. Seleccione el área que se va a fotografiar y la resolución deseada; en este informe se utilizó un modo de adquisición de alta velocidad (espectros adquiridos bajo iluminación láser continua con la platina del microscopio en constante movimiento, con una resolución espacial efectiva de 14,2 μm por 200 μm; con un aumento de 5x, una potencia de 100 mW en el objetivo y una exposición de <100 ms por punto)
nota: Los tubos con las nanosondas de referencia del Paso 4.1 se pueden colocar dentro del área de la imagen si se desea, para proporcionar estándares de referencia internos para el análisis posterior. Asegúrese de que ninguna fuente de luz extraña que no sea el láser llegue al objetivo.
- Opcionalmente, prepare la muestra para el procesamiento histológico y la validación por fijación en paraformaldehído al 4% en PBS durante la noche a 4 °C. Enjuague con PBS a 4 °C durante 15 min al menos dos veces. Mantenga la muestra en etanol al 70% en agua hasta el procesamiento histológico estándar y la inclusión en parafina. Para la validación histológica de los tumores, se pueden teñir secciones (de 5 μm de grosor) de diferentes profundidades del bloque de parafina con hematoxilina y eosina (H&E).