Sistema de cultivo proximal: una técnica de cultivo in vitro para estudiar la señalización paracrina entre células

Resumen

Fuente: Dasari, S. et al. Un método de cultivo proximal para estudiar la señalización paracrina entre células.J. Vis. Exp. (2018)

En este video, desarrollamos un modelo de cocultivo proximal de células de cáncer de ovario y células mesoteliales humanas primarias. Este modelo fisiológicamente relevante permite el estudio de la señalización paracrina, donde se mantienen las concentraciones localizadas de los factores secretados al tiempo que se evita el contacto celular directo.

Protocolo

A. Preparación de la célula

1. Aislamiento y cultivo de células mesoteliales primarias humanas
   1. Aislar las células mesoteliales primarias humanas (HPMC) del epiplón humano y cultivarlas en un medio de crecimiento completo [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de vitaminas] a 37 °C y 5% de CO₂.
      nota: Por lo general, las HPMC se cultivan hasta alcanzar una confluencia del 100 % (Figura 1A).
2. Condiciones de crecimiento de las células de cáncer de ovario
   1. Cultive células de cáncer de ovario HeyA8 en un medio de crecimiento completo a 37 °C y 5% de CO₂.
      nota: Utilice células HeyA8 cultivadas hasta aproximadamente un 80% de confluencia (Figura 1B).

B. Cultivo celular

1. Configuración del cultivo proximal
   1. Utilice insertos Transwell para placas de 6 pocillos con una membrana de policarbonato tratada con cultivo de tejidos de 10 μm de espesor con poros de 0,4 μm (10⁸ poros/cm²) y un área de crecimiento de 4,67 cm². Si es necesario, optimice para diferentes tamaños de plaquita escalando el número de celdas sembradas de acuerdo con el área de superficie de crecimiento. Calentar el medio de crecimiento completo, la tripsina y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C antes de usar.
2. Preparación de los insertos
   1. Para sembrar las células HeyA8 en la superficie inferior de la membrana del inserto, retire el inserto de su embalaje con pinzas estériles y colóquelo invertido en una placa de cultivo estéril de 15 cm.
   2. Utilice un plato de 15 cm, ya que tiene la profundidad necesaria para alojar el inserto invertido, o sustitúyalo por cualquier recipiente estéril adecuado. Dependiendo del experimento, coloque el número requerido de insertos en el plato de 15 cm.
   3. Etiquete los tres controles y las tres condiciones experimentales en consecuencia con un marcador en el borde de las inserciones.
3. Preparando las células cancerosas
   1. Para tripsinizar las células HeyA8 cultivadas al 80% de confluencia en un matraz de 25^cm2 (~2 x 10⁶ células), añadir 1 mL de tripsina (0,25%) durante 40-60 s y neutralizar la tripsina con 6 mL de medio de crecimiento completo.
   2. Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente (RT) durante 3 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 5 mL de medio de crecimiento completo. Cuente las células vivas utilizando el método de exclusión del colorante azul tripano.
4. Sembrando las células cancerosas
   1. Suspenda 100.000 células/mL de células HeyA8 vivas en un medio de crecimiento completo. Siembre con cuidado 80.000 células HeyA8 suspendidas en 800 μL de medio de crecimiento completo en la parte inferior del inserto (que ahora está hacia arriba, ya que está invertido).
   2. Siembre las celdas para formar una forma de cúpula para que las celdas permanezcan en el inserto (Figura 1C). Comience desde el centro de la membrana y muévase hacia afuera en círculos concéntricos mientras pipetea lentamente. Evite alejarse más de 3 mm del borde para evitar cualquier derrame del medio.
      nota: El número de células sembradas dependerá de la tasa de crecimiento de las células y de la duración del experimento. Se optimizó el número de células HeyA8 sembradas para este cultivo proximal, y las células tendrán una confluente del 80-90% al final del tercer día.
5. Adhesión de células cancerosas
   1. Cubra el plato de 15 cm y mueva con cuidado el plato que contiene los insertos a la incubadora de CO₂. Es fundamental no interrumpir la caída de medio y células en el inserto en este paso. Deje las células a 37 °C durante 4 h para permitir que las células cancerosas se adhieran al inserto.
6. Preparando las células mesoteliales
   1. Después de unas 4 h, tripsinice las HPMC cultivadas al 100% de confluencia en un matraz de 75^cm2 (~4 x 10⁶ células) con 2 mL de tripsina (0,25%) durante 1-2 min y neutralice la tripsina con 12 mL de medio de crecimiento completo.
   2. Centrifugar las células a 500 x g en RT durante 3 min, resuspender el pellet de células en 10 mL de medio de crecimiento completo y contar las células vivas utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano.
7. Sembrando las células mesoteliales
   1. Suspenda 300.000 células/ml de HPMC vivas en un medio de crecimiento completo. Agregue 2.5 mL de medio de crecimiento completo fresco a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Lleve con cuidado el plato de 15 cm que contiene los insertos a la campana de bioseguridad. Con pinzas estériles, voltee el inserto y colóquelo en el pocillo de la placa de 6 pocillos de modo que quede en posición vertical, con las células HeyA8 unidas a la superficie inferior sumergidas en el medio de crecimiento completo (Figura 1C).
   2. Siembra 450.000 HPMCs suspendidas en 1,5 mL de medio de crecimiento en el interior de los insertos con las células HeyA8 adheridas a la superficie orientada hacia el fondo del pocillo (Figura 1C) o a insertos sin ninguna célula HeyA8 para los controles HPMC. Añadir 1,5 mL de medio de crecimiento sin células a los controles HeyA8.
8. Crecimiento de la cultura proximal
   1. Deje que el cultivo proximal crezca en la incubadora de CO₂ a 37 °C y 5% de CO₂ durante 72 h. Si es necesario, el medio se puede reponer de la siguiente manera.
      1. Para el interior del inserto, retire 750 μL y agregue 750 μL de medio de crecimiento completo fresco.
      2. Para el exterior del inserto (la placa de 6 pocillos), retire 1 mL y agregue 1 mL de medio de crecimiento completo fresco. Se eligió el de 1 mL por la comodidad de cambiar el medio en un solo paso. Si se desea, se pueden extraer 1,25 ml y reemplazarlos.

Resultados

Figura 1: Montaje del sistema de cultivo proximal.(A) Este panel muestra células mesoteliales primarias humanas (HPMC). (B) Este panel muestra células de cáncer de ovario HeyA8. Barras de escala = 200 μm (A-B). (C) Las células HeyA8 se sembraron en la superficie inferior de un inserto transpocillo con poros de 0,4 μm. Una vez que se u...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soporte permeable Transwell de 24 mm con inserto de membrana de policarbonato de poro de 0,4 μm	Corning (Costar)	3412	• Membrana de policarbonato translúcido de 10 μm de espesor. • Tratamiento para una óptima adherencia de las células. • Empaquetado 6 insertos en una placa de 6 pocillos, 4 placas por caja. • La membrana debe estar teñida para la visibilidad de las células. • Esterilizado por radiación gamma.
Placa de 6 pocillos	Corning (Halcón)	353046	Fondo plano, tratado con TC, estéril, con tapa
Plato de cultivo de 15 cm	Corning (Halcón)	353025	Placa de cultivo celular estéril tratada con TC
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicilina Estreptomicina	Corning	30-002-CI
MEM Aminoácidos no esenciales	Corning (Cellgro)	25-025-CI
Pipetas			Cualquier marca está bien
Incubadora de CO2			Cualquier marca está bien
Gabinete de bioseguridad de nivel II			Cualquier marca está bien